葡萄糖氧化酶是二聚体蛋白质，它催化β-D-葡萄糖氧化成过氧化氢和D-葡糖酸-1,5-内酯，后者被水解成葡萄糖苷酸。它广泛用于测定体液中的葡萄糖以及从饮料，食品和其他农产品中去除残留的葡萄糖和氧气。此外，葡萄糖氧化酶通常用于生物传感器中以检测葡萄糖。

翌圣生物提供的Glucose Oxidase Fluorimetric Detection Assay Kit（Red Fluorescence）葡萄糖氧化酶荧光检测试剂盒(红色荧光)为溶液中葡萄糖氧化酶的测量提供了一种快速而灵敏的方法。它可以方便的在96孔或384孔微量滴定板上进行操作，且无需分离步骤即可轻松适应自动化。荧光信号可以通过荧光酶标仪或吸光度酶标仪轻松读取，可在100 μL反应体积中检测到低至0.05 mU/ mL的葡萄糖氧化酶。

组分信息

使用说明

1.溶液制备

1.1储备溶液

建议将未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-25~-15℃的条件下，避免反复冻融循环。

1）Amplite Red储备液（250X）：

将100 μL DMSO（组分E）加入到 Amplite Red（组分A）的小瓶中，应立即使用原液。【注意：在硫

醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇的存在下，Amplite Red不稳定，反应中DTT或2-巯基乙醇的最终浓度应不高于10 μM。Amplite Red 在高pH（> 8.5）下也不稳定，因此，反应应在pH 7-8下进行，推荐提供的测定缓冲液（pH 7.4）。】

2）HRP储存溶液制备（50X）：

将1 mL的测定缓冲液（组分B）加入到辣根过氧化物酶（组分C）的小瓶中。

3）葡萄糖氧化酶标准溶液的制备（100 U/mL）：

将1 mL的测定缓冲液（组分B）加入葡萄糖氧化酶小瓶（组分D）中。

4）葡萄糖原液（10X）：

将5 mL测定缓冲液（组分B）加入葡萄糖小瓶（组分F）中。

1.2标准溶液（葡萄糖氧化酶标准溶液）

将2 μL 的100 U/mL的葡萄糖氧化酶标准溶液稀释到200 μL的测定缓冲液（组分B）中来制备葡萄糖氧化酶标准品，先制备1000 mU/mL的葡萄糖氧化酶标准溶液，然后取10 μL 1000 mU/mL葡萄糖氧化酶标准溶液，进行100倍的稀释，得到10 mU/mL 葡萄糖氧化酶标准溶液（GOS7）。然后按1：2比例依次稀释以获得其他浓度的葡萄糖氧化酶标准品（GOS6-GOS1）。【浓度信息为：GOS6：3.3333 mU/mL；GOS6：1.1111 mU/mL；GOS6：0.3704 mU/mL；GOS6：0.1235 mU/mL；GOS6：0.0412 mU/mL；GOS6：0.0137 mU/mL】。包括非葡萄糖氧化酶缓冲液作为空白对照，最终的葡萄糖氧化酶浓度应低两倍（即0至5 mU/mL）。注意：高浓度的葡萄糖氧化酶可能会因Amplite Red（非荧光产物）的过氧化而导致荧光信号降低。

1.3工作溶液

将20 μL的Delterite Red储备液（250X），100 μL的HRP储备液（50X）和 500 μL的葡萄糖储备液（10X）加入4.4 mL测定缓冲液（组分B）中，使总体积为5 mL 葡萄糖氧化酶（GO）工作溶液，注意避光。

2.样品分析

2.1根据表1和表2中提供的布局制备葡萄糖氧化酶标准品（GOS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 μL试剂代替50 μL。

2.2在葡萄糖氧化酶标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 μL GO工作溶液，使总葡萄糖氧化酶测定体积为100 μL/孔，对于384孔板，在每个孔中加入25 μL GO工作溶液，总体积为50 μL/孔。

2.3将反应在37°C避光孵育10至30分钟。

2.4用荧光酶标仪在激发=530-570 nm，发射=590-600 nm（最佳Ex/Em=540/590nm）读取荧光强度。【注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 然而，与荧光读数相比，吸收检测具有更低的灵敏度。】

表1 实心黑色96孔微孔板中葡萄糖氧化酶标准品和测试样品的布局[GOS =葡萄糖氧化酶标准品（GOS1-GOS7,0.01至10 mU/mL），BL =空白对照，TS =测试样品]

表2 每个孔的试剂组成

3.实验方案概述

3.1在开始实验之前，将所有试剂盒组件解冻至室温。

3.2准备GO工作溶液（50 μL）。

3.3添加葡萄糖氧化酶标准品或测试样品（50 μL）。

3.4在37°C避光孵育10-30分钟。

3.5监测Ex/Em =540/590 nm处的荧光强度。

-25~-15℃避光保存，有效期12个月。