一步法、恒温扩增、肉眼判读：翌圣40615 LAMP（2G）支原体快速检测方案

2026-09-17

行业背景:支原体—细胞培养的“隐形杀手”

支原体是一类无细胞壁、直径仅 0.1~0.3 μm、能穿透 0.22 μm 标准除菌滤器的最小可独立复制原核生物。在细胞培养体系中,它隐蔽性强、培养基不浑浊、可逃逸常规抗生素清除,是单抗、重组蛋白、疫苗、CGT 等生物制品全流程重点监控的外源污染因子。

1.1 五大生物学特性,让支原体成为“最难发现的污染”

●形态小:0.1~0.3 μm,无细胞壁,革兰氏染色无效,光学显微镜难以直接识别。

●可滤过:可穿透 0.22 μm(部分可达 0.1 μm)标准除菌滤器,常规澄清工艺无法完全拦截。

●强隐蔽:液体培养基不浑浊,细胞形态早期无明显变化,目视/光镜均无法识别,平均潜伏期 2~3 周。

●耐抗生素:对青霉素等作用于细胞壁的抗生素天然耐药,常规培养液添加无法清除,反而掩盖污染。

●传播广:经细胞、血清、胰酶、操作人员、器材气溶胶等多种途径扩散,易在群批中爆发,批次报废代价高。

1.2 行业数据:污染率与典型菌种

15~35%

研究级细胞系历史污染率

Drexler & Uphoff, Cytotechnology, 2002

0.4~6.7%

近年商业送检样本污染率

bioprocesstools.com, 2024

5 种

药典重点监控支原体
口腔支原体 / 肺炎支原体 / 猪鼻支原体 / 唾液支原体 / 精氨酸支原体

~10⁷ CFU/mL

CHO 反应器污染峰值

Fratz-Berilla et al. 2019, Biotechnol Bioeng

1.3 真实案例:M. arginini 污染 CHO 生物反应器,抗体纯度从 96.2% 跌到 56.3%

美国 FDA CDER 团队 Fratz-Berilla 等在一次性灌注摇摆生物反应器中模拟了 CHO DG44(IgG1 单抗)真实生产场景下的精氨酸支原体污染,系统解析了污染对细胞生长、代谢与关键质量属性的影响。该团队先后发表两篇论文:2019 年报道生物反应器培养层面的影响(Biotechnol Bioeng, 116(12):3242-3252),2020 年报道对单抗产品关键质量属性的影响(Biotechnol Bioeng, 117(9):2802-2815)。

表1：M. arginini污染对CHO生物反应器关键指标及抗体质量的影响

指标	未污染对照	M. arginini 污染后	影响 / 风险
抗体纯度	96.2%	56.3%	↓ 40 个百分点,直接关及产品质量
高甘露糖糖型占比	极低	16.2~17.4%	↑ 显著偏离质量标准,影响药效
酸性电荷变异体	基线水平	显著升高	影响稳定性与免疫原性
精氨酸浓度	稳定	3~4 天骤降 90% 以上	培养基耗竭,细胞代谢异常
氨浓度	~4 mM(CHO 耐受阈值)	25~30 mM(持续累积)	远超耐受,直接导致 CHO 死亡
M. arginini 峰值	0 CFU/mL	~10⁷ CFU/mL	由培养基营养决定,与初始接种量无关

支原体检测合规要求

支原体一旦进入收获液、原液等关键工艺物料,会随药品进入临床,直接威胁患者安全。全球主要药监机构对细胞库、病毒种子批、收获液、原液、终产品的支原体检查均有强制要求,合规检测是生物制品放行的硬性指标。

•目前ChP3301、USP <63>、EP2.6.7(12.2)等法规标准中，LAMP作为NAT技术，主要定位于内部初筛与过程监控，需按药典对NAT的要求完成方法学比对与验证。

•EP 2.6.7(12.2)已将 NAT 正式赋予与培养法等效的地位,但明确要求完成产品专属基质中的方法验证,包括基质抑制试验、检出限确认、外部阳性对照工作浓度标定等。

•LAMP 适合作为内部初筛和过程监控工具:覆盖研发样本筛查、原辅材料入库、工艺过程中间品、病毒 / 细胞库辅助初筛,阳性结果须用药典认可方法或经验证 NAT 复核。

•终产品放行仍需执行药典培养法 + 指示细胞法,或按 ChP 9201 / EP 2.6.7(12.2) 完成验证的 qPCR / NAT 替代方案;快速放行场景可参考 CDE 2022 年第 30 号、CDE 2023 年第 33 号。

检测方法对比:培养法、指示细胞法、qPCR、LAMP

目前主流的支原体检测方法可分为三大类:传统培养法、指示细胞染色法、分子检测法(NAT—包括 PCR / qPCR / LAMP 等)。在工艺的不同阶段,选择合适的检测方法并合理组合,是构建完整支原体质控防线的关键。

表 2:四类支原体检测方法对比

方法	原理	检测限 / 灵敏度	周期	适用阶段	设备要求
培养法(药典)	液体 / 固体培养基培养支原体,观察 pH 变化与“油煎蛋”菌落(菌落直径通常 0.1~1.0 mm)	按药典培养基灵敏度检查法(变色单位试验)确定:肺炎支原体应达 10⁻⁸、口腔支原体应达 10⁻⁴(变色单位),不以 CFU/mL 直接表示	≥21~28 天	终产品放行、申报合规	CO₂ 培养箱、厌氧 / 微需氧环境
指示细胞法(药典)	支原体 DNA 与荧光染料(Hoechst 33258 / DAPI)结合,指示细胞表面呈荧光小点	按药典指示细胞培养法判定,不单独以 CFU/mL 表示	3~5 天	终产品放行(常与培养法联合)	荧光显微镜、指示细胞(Vero 等)
qPCR(NAT 的一种,经方法学验证后可用于放行替代)	TaqMan 探针法定量扩增支原体 16S rRNA 等保守区	≤10 CFU/mL(需按 ChP 9201 完成方法学验证)	2~3 小时	过程监控、放行(验证后)	荧光定量 PCR 仪
LAMP(本方案)	Bst 聚合酶 63°C 等温扩增,染料颜色变化肉眼判读	500 copies/μL( DNA 层面);100 CFU/mL 标准菌株稀释 2 倍仍可检出	40 min	研发 / 入库 / 过程初筛	水浴 / 金属浴 / PCR 仪,无需电泳

建议组合策略:LAMP 快速初筛(40615)+ qPCR 复核 / 申报(40619)+ 药典培养法 + 指示细胞法终放行,构建“三级组合”完整质控防线。

解决方案:翌圣 40615 一步法快速支原体检测试剂盒(LAMP)(2G)

翌圣一步法快速支原体检测试剂盒(LAMP)(2G),货号 40615ES(规格 5 T / 25 T / 100 T),基于翌圣自研的环介导等温扩增(LAMP)技术,针对支原体 16S-23S rRNA 序列保守区域设计特异性引物,可在 63°C 恒温 40 min 内对细胞培养上清、血清、收获液等样本完成支原体定性初筛。若样本被支原体污染,支原体 DNA 保守序列会被大量快速扩增,反应液由蓝紫色变为天蓝色,结果肉眼可辨,无需电泳。

LAMP 技术由 Notomi 等于 2000 年首次报道(Notomi T. et al., NAR 28(12):e63),核心是利用具有强链置换活性的 Bst DNA 聚合酶,在恒温条件下通过 4 条核心引物(2 内 + 2 外,识别 6 个靶区)实现 10⁹ 级别的扩增;产物可通过焦磷酸镁浊度、pH 指示剂或 SYBR Green 等多种方式判读,适合现场快速检测。

相较于老款一步法支原体检测试剂盒,2G 版本降低了假阳性率、提高了检测准确度,并增强了阴性与阳性的颜色辨识度:扩增结束后在室温放置一段时间,也不会出现由阴性转变为阳性的现象,不影响阴、阳性判断。

4.1 适用场景

科研样本筛查稳转细胞株、各类培养细胞上清日常支原体监控;血清、培养基等原辅材料入库快速初筛。	工艺开发与生产过程监控细胞发酵、病毒包装工艺摸索、大规模细胞培养收获液及纯化前中间品的高频初筛。及时识别污染苗头,用于过程风险预警
病毒及细胞库辅助初筛病毒种子批、慢病毒 / 逆转录病毒包装上清、MCB/WCB 复苏样本快速排查。	CGT 与方法学研究 CAR-T 等 CGT 细胞制剂制备过程内部风险预警,制剂放行需药典合规检测;同时可用于企业内部方法学比对评估。

4.2 六大产品特点

简单快捷一步法加样,63°C 恒温 40 min 出结果;水浴 / 金属浴 / PCR 仪均可,无需电泳。	普适性高可直接以细胞培养上清、血清、菌株等生物材料为模板,无需核酸提取。
检测范围广覆盖 33 种支原体,含国内外药典法规要求的口腔支原体 / 肺炎支原体 / 猪鼻支原体 / 唾液支原体 / 精氨酸支原体5 种重点监控支原体。	灵敏度高检测下限 500 copies/μL(质粒模板);对 100 CFU/mL 支原体标准菌株(原液及 2 倍稀释)仍可正常扩增并显色。
防污染设计配套性阳性对照;说明书建议在超净台配制组分、加入矿物油封层、减少反应后开盖次数,以降低假阳性风险。	2G 升级版较基础版降低假阳性率、提高准确度、增强阴 / 阳性颜色辨识度;扩增结束室温放置不会由阴性转为阳性。

操作要点与温度敏感性提示

●本试剂盒所用酶对温度非常敏感,强烈建议使用 PCR 仪操作;若使用水浴锅,须先加热至 63~65°C 后再反应,反应温度低于 63°C 可能引起假阳性。

●63°C 反应时间为 40 min,须准确计时;反应时间仅可适当延长约 10 min,不可缩短。超过规定时间或反应管开盖,均可能出现假阳性。

●样本建议:贴壁细胞直接吸取上清;悬浮细胞 500 g 离心 5 min 后取上清。建议传代或换液 3 天以上、汇合度约 90% 时取样,此时支原体含量较高,便于检出。

4.3 性能验证:核心参数一表速览

项目	40615 性能指标
检测原理	环介导等温扩增(LAMP),Bst DNA 聚合酶,63°C 恒温
靶标区域	支原体 16S-23S rRNA 序列保守区
覆盖种类	33 种支原体(经 NCBI BLAST 引物比对确认;含药典重点监控 5 种)
DNA 层面检测下限	500 copies/μL
活菌层面检出能力	100 CFU/mL 标准菌株可正常扩增显色;稀释 2 倍后 5 种支原体仍全部检出
反应条件	63°C 恒温 40 min;时间可延长约 10 min,不可缩短
反应模式	PCR 仪(推荐)/ 金属浴 / 水浴锅(须预热至 63~65°C)
样本类型	细胞培养上清、血清、菌株、收获液等,无需核酸提取
判读方式	反应液由蓝紫色变为天蓝色,肉眼判读
交叉特异性	与 9 种近亲缘菌基因组 DNA(10 ng/T)、细胞基因组 DNA(30 ng/T,含 293T / CHO / E. coli / S. cerevisiae)无交叉反应
耐用性	37°C 热加速 7 天、-20°C 冻融 20 次、干冰冻融 50 次、干冰运输后性能无影响

图 1:40615 试剂盒组成(40615-A Buffer / 40615-B Enzyme / 40615-C Primer / 40615-D 矿物油 / 40615-E Positive Control)

4.4 灵敏度内部对标:100 CFU 标准品

样本 1/6:肺炎支原体;样本 2/7:精氨酸支原体;样本 3/8:猪鼻支原体;样本 4/9:唾液支原体;样本 5/10:口腔支原体。翌圣 40615 在 100 CFU 标准品原液及 2 倍稀释条件下均能检出阳性,而对照竞品 A 在 100 CFU 标准品原液未检出阳性。

图 2:100 CFU 标准品灵敏度内部对标(翌圣 40615 vs 竞品 A) — 阴性(蓝紫)vs 阳性(天蓝)。

结语:LAMP快速检测方案与质控组合策略

LAMP等温扩增技术凭借操作简单、无需大型仪器的优势，既适合高校、科研院所的基础科研用于日常细胞培养的快速风险预警，也适合生物医药企业用于原材料入库、工艺过程监控的支原体快速筛查。翌圣一步法快速支原体检测试剂盒(LAMP)(2G)依托自研等温扩增酶原料与 LAMP 技术,作为内部初筛预警工具,建议搭配翌圣 qPCR 支原体试剂盒(40619)以及药典经典方法联合使用,为单抗、重组蛋白、疫苗、CGT 等赛道生物医药企业以及广大科研实验室提供高效、经济的支原体筛查手段，助力科研数据可靠，辅助企业做好细胞基质污染风险前置管控。

选购指南：

核心产品名称	货号	核心应用场景
支原体PCR检测试剂盒（巢式PCR）(2G)	40614ES	微量低载量支原体深度筛查
一步法快速支原体检测试剂盒（LAMP）（2G）	40615ES	高通量初筛，无需荧光定量仪
支原体qPCR检测试剂盒（探针法）（2G）	40619ES	CGT 终产品放行、细胞库检定、IND 申报首选