在微生物研究的版图上，16S rRNA测序早已成为细菌和古菌研究的“黄金标准”。然而，当我们把目光投向真菌、藻类、原生动物乃至更复杂的真核微生物时，16S便无能为力了——因为真核生物的核糖体小亚基，用的是另一套“身份证”：18S rRNA基因。

18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，长度约1500–2000 bp。和16S一样，它也由保守区和高变区交替排列而成——保守区是跨物种的通用“路标”，高变区则是各物种独有的“指纹”。18S rRNA基因共有9个可变区（V1–V9，缺少V6区），其中V4区使用最广、数据库信息最全、分类效果最好，是18S分析注释的首选区域。

与专注于真菌种级鉴定的ITS测序不同，18S测序覆盖的是整个真核微生物域——从真菌到藻类，从原生动物到后生动物，一网打尽。如果说ITS是“狙击枪”，精准锁定真菌；那18S就是“广角镜”，让你看见整个真核微观世界的全景。两者各有所长，互为补充。

那么，这面“广角镜”究竟能照见怎样的世界？

18S测序最广阔的应用舞台，无疑是环境生态学。一项研究重新分析了超过6000份环境样本的18S rRNA基因V4区数据，涵盖海洋、淡水、土壤、高盐、极地等各类栖息地。结果显示，非子囊菌-担子菌类真菌在极端环境中——高盐湖、深海沉积物、极地——常常是优势真菌类群。这些以往因形态隐蔽、难以培养而被称作“暗物质真菌”的生物，借助18S测序终于浮出水面。

在沙特阿拉伯NEOM地区的盐滩（sabkha）土壤中，研究者首次运用18S rRNA基因eDNA宏条形码技术，在20份土壤样本中鉴定出6个门、21个目、32个科、35个属的微真核生物，子囊菌门和硅藻门占据主导地位。在中国西藏南部的34个温泉中，18S rDNA高通量测序揭示了微真核生物中特化种与泛化种截然不同的群落构建机制——温度、pH、海拔等环境因子对两类物种的影响各有侧重。

从喀斯特森林不同演替阶段的土壤真核微生物，到岩溶断陷盆地不同土地利用方式下的土壤生物群落——18S测序让生态学家第一次系统看清了真核微生物在全球生态系统中的分布图景。

海洋和淡水中的真核浮游生物是食物网的关键一环，也是生态系统健康的“晴雨表”。18S rRNA基因的V4和V9区域已被广泛用于靶向微真核生物，成为沿海生态系统中环境胁迫响应的重要生物指示物。

在贵州万峰湖，研究者利用18S rRNA高通量测序比较了丰水期和枯水期的真核浮游生物多样性。在三峡库区大宁河，18S测序揭示了不同水华时期真核浮游生物群落的动态变化。海南近岸海湾的研究则通过18S rRNA V4区测序，为预测赤潮发生和改善水体质量提供了科学依据。珠江口的研究更进一步，利用18S rDNA V4区高通量测序系统分析了真核生物共生与寄生类群的群落结构及其季节变化。

更前沿的是，研究者已经开始区分水体中活跃、休眠和死亡的微生物——在一项热带沿海研究中，通过同时靶向16S和18S rRNA基因及其转录本的三重宏条形码方法，发现死亡微生物在沉积物中贡献了高达44%的序列和80%的丰富度。这意味着，仅靠DNA测序可能会高估活跃微生物的多样性，而18S测序正在帮助我们穿透这层“DNA迷雾”。

在临床领域，18S测序正成为寄生虫和深部真菌感染诊断的利器。16S rRNA测序主攻细菌，18S rRNA和ITS序列则负责真菌和寄生虫等真核微生物的鉴定分析。

针对血液寄生虫，研究者开发了靶向18S rDNA的扩增子深度测序策略。在肠道寄生虫检测方面，18S和28S rDNA通用引物的宏条形码技术已展现出良好前景。一篇系统综述指出，1993年至2025年间93%的疟疾PCR检测仍依赖18S rRNA基因靶点——尽管研究者也在呼吁探索多拷贝靶点，但这恰恰说明18S rRNA在疟疾分子诊断中无可替代的核心地位。

真菌鉴定方面，18S rDNA高通量筛查已可与ITS PCR和传统培养方法相媲美。对于形态相似、难以区分的真菌、酵母菌、霉菌，18S rDNA测序提供了精准的分类鉴定方案。

食品安全关乎每个人的健康。18S rRNA测序已被用于检测熟制坚果籽类产品和冲调谷物制品中的霉菌污染。研究者将18S rRNA测序与微生物飞行时间质谱两种方法进行比较，评估其在霉菌种属鉴定中的一致性。在发酵食品领域，18S测序可用于监控真菌群落的动态变化，为品质控制提供科学依据。

农业方面，通过分析作物根际的真核微生物群落，18S测序帮助研究者理解真菌和原生生物在土壤健康与作物生长中的作用。

中药材基原混乱一直是困扰质量控制的难题。18S rRNA基因序列正在成为中药鉴定的“分子身份证”。研究者利用18S rRNA基因测序成功鉴定了山药及其地方习用品——广山药与正品山药的18S rRNA序列完全相同，而土山药和方山药的序列同源性分别为99.89%和97.51%。冬虫夏草和新疆虫草的鉴别中，18S序列与ITS序列共同作为DNA条形码发挥了关键作用。五鹤续断、三七等中药材的18S rRNA基因序列分析，也为分子鉴定提供了可靠依据。

18S测序技术本身也在快速迭代。传统短读长测序通常只能将微生物鉴定到属水平，而随着纳米孔、PacBio等长读长测序技术的成熟，全长18S rRNA基因测序正在实现更高分辨率的分类鉴定。研究者已能扩增几乎完整的18S rRNA基因片段用于纳米孔测序，显著提高了分类学分辨率。

与此同时，从DNA到RNA的跨越正在发生——通过同时测序18S rRNA基因及其转录本，研究者可以区分活跃微生物与休眠、死亡微生物，真正“看见”谁在生态系统中“干活”。环境DNA（eDNA）技术与18S测序的结合，更让不破坏生态系统即可监测生物多样性成为现实。

18S rRNA测序，是打开真核微观世界大门的一把钥匙。从沙特阿拉伯的极端盐滩到西藏高原的温泉，从珠江口的浮游生物到患者体内的寄生虫，从餐桌上的坚果到药房里的中药材——这项技术正在以前所未有的广度和深度，重塑我们对真核微生物世界的认知。它不是16S的“配角”，而是与之并肩的另一只眼睛——一只让我们看见真核生命之绚烂的眼睛。微观世界的大门已经敞开，而18S测序，正引领我们走进一个更加丰富多彩的真核宇宙。

样品收集：收集待鉴定的中药材样品，包括单一药材或混合中成药。应根据研究目的采集足够数量的样品（建议每个物种至少5个重复个体）。对于形态学鉴定困难的材料，建议由分类学专家进行基原鉴定。

样品处理：新鲜或干燥的组织样品可采用硅胶干燥保存，以抑制DNA降解；对于含多糖多酚类物质的中药材，需采用专门优化的DNA提取方法；对于颗粒状或丸状中成药，应对样品进行充分研磨。

参考样品：建议同时采集基原植物的凭证标本，保存于标本馆，以备后续溯源和验证。

DNA提取：使用商用试剂盒（如MolPure® Mag Plant DNA Kit（18529ES，植物通用DNA提取）或MolPure® Mag Soil/Stool DNA Kit（18526ES磁珠法土壤/粪便DNA提取试剂盒）），严格按照说明书提取总DNA，并测定DNA浓度和质量（OD260/280在1.8–2.0之间为佳）。

DNA浓度测定：使用qubit定量设备（单通道核酸定量仪80571ES、83509ES，96通道核酸定量仪80575ES、83652ES）搭配qubit试剂（12642ES）测定浓度。

1) 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads（12601ES）磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min，配制80%乙醇。

2) 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3) 吸取 45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一轮PCR产物中，室温孵育5 min。

4) 将 PCR 管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约 5 min），小心移除上清。

5) 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec后，小心移除上清。

6) 重复步骤5，总计漂洗两次。

7) 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。

8) 直接加入11 μL ddH2O，将PCR 管从磁力架中取出，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。进入下一步反应。

取1 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（10208ES），确认目标条带明亮清晰，无非特异性扩增。

二次PCR（添加样品标签与测序接头）

二次PCR加标签：以纯化后的一次PCR产物为模板，使用带Illumina或者MGI接头的引物进行二次PCR扩增（13344ES），为每个样品添加独特的index标签，以便混合测序后区分不同样品。

纯化二次PCR产物：再次使用磁珠法纯化加标签后的文库产物（12601ES）。

直接搭配通用建库试剂即可完成三代文库构建（13306ES）。

建库完成后，对文库进行纯化以便后续上机测序（12601ES）。

浓度检测：使用qubit定量设备（单通道核酸定量仪80571ES、83509ES，96通道核酸定量仪80575ES、83652ES）搭配qubit试剂（12642ES）测定浓度。

等摩尔混合：将所有样品文库按等摩尔浓度混合，形成最终的测序pool。

高通量测序：将混合文库送检至NGS平台，常用平台包括Illumina NovaSeq、MGI T7或ONT、Cyclone等测序仪。

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