一、背景介绍

1.1 中草药鉴定的传统方法及其局限

中药材品种混乱及真伪鉴定方法欠缺，严重影响中医药的疗效和安全。传统的中草药鉴定方法主要依赖形态学分析、解剖学分析和化学成分指纹图谱等技术。然而，这些方法面临显著局限：一方面，环境条件、发育阶段或表型可塑性等因素会影响叶片形态和组织结构等性状，导致物种误判；另一方面，这些方法难以区分亲缘关系近的物种或品种，无法满足当前质量控制标准所要求的精度。

随着全球化和草药产品需求增长，掺假和替代风险日益加剧。比利时在1990年代曾因将有毒的Aristolochia fangchi误认为无毒的Stephania tetrandra，导致超过100名女性肾衰竭。全球植物性膳食补充剂市场预计将从2021年的405.4亿美元增长至2028年的805.4亿美元，市场规模的快速扩张使得建立可靠的中药材鉴定方法变得尤为迫切。

1.2 DNA条形码技术原理

DNA条形码技术是利用基因组中一段标准化的短DNA序列来进行物种鉴定的分子生物学方法。该技术的核心假设是：种内遗传变异通常小于种间遗传差异，因此可以通过比对目标序列与参考数据库来鉴定未知样本。在中草药鉴定领域，陈士林研究团队经过近十年的研究，完成了4000余种中草药及其混伪品的DNA条形码研究，创建了“中草药DNA条形码生物鉴定体系”，从基因层面解决了中药材与混伪品的鉴定问题。

1.3 DNA宏条形码技术的兴起

传统DNA条形码技术通常适用于单一物种样本的鉴定。然而，绝大多数中成药和中草药产品由多种药材混合而成，基于单一样品Sanger测序的传统方法难以应对混合物种的鉴定需求。DNA宏条形码技术的出现填补了这一空白。

DNA宏条形码是利用高通量测序技术（NGS）获得混合条形码扩增序列，再通过生物信息学分析手段来鉴定混合样本中物种组成的方法。该技术已广泛用于宏基因组学、动植物生物多样性等研究，并开始应用于传统草药的鉴定领域，为混合草药物种鉴定困难提供了有力的手段。

1.4 NGS在中药鉴定中的技术路径

下一代测序技术在中草药鉴定中的应用主要包括两条技术路径：扩增子宏条形码和鸟枪法宏条形码。

扩增子宏条形码是目前应用最为广泛的方法。该方法采用通用引物对混合样本中的特定条形码区域（如ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL等）进行PCR扩增，然后对扩增产物进行高通量测序，通过序列聚类和比对分析鉴定混合样本中的物种组成。

鸟枪法宏条形码则是直接对混合样本的总DNA进行随机打断和测序，无需预先PCR扩增特定区域。该方法能够同时鉴定植物、真菌和动物成分，在一次测序中获得更全面的物种组成信息。例如，在Wuhu San的研究中，研究人员通过鸟枪法宏条形码对5个中成药样本进行了测序，共获得37.14 Gb数据，成功检测到ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL等目标区域序列，并鉴定出多个药材成分及24个真菌属。

此外，三代高通量测序技术（如PacBio和Nanopore）因能够产生更长的测序读长，在解决序列拼接问题和区分复杂混合样本方面展现出独特优势，正在成为DNA宏条形码在混合中草药鉴定中不可或缺的技术方向。

二、DNA宏条形码在中草药鉴定中的应用

2.1 单一药材的真伪鉴别

DNA条形码技术已广泛应用于单一中草药基原植物的真伪鉴别。研究团队采用ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL等国际通用的条形码序列，对蒙药材刺柏叶及其混淆品圆柏叶进行DNA提取和扩增，结果发现psbA-trnH序列能有效区分圆柏叶与刺柏叶。在黄精属药用植物鉴定中，研究人员应用通用引物扩增44份黄精属样品的叶绿体rbcL、matK、psbA-trnH及核ITS2和ITS序列，系统评价了各候选序列的鉴定能力。

2.2 混合中草药产品鉴定

混合中草药产品的物种鉴定是DNA宏条形码技术最具价值的应用方向之一。常见的中成药和中草药茶包含多种药材成分，传统方法难以有效区分。研究人员已建立了基于高通量测序的混合草药茶物种鉴定体系，通过设计两端加标签的ITS2引物序列，结合MiSeq高通量测序平台，实现了混合样品中多种原料物种的鉴定。

在中药复方制剂“五虎散”的研究中，鸟枪法宏条形码技术在两种模拟混合样本中成功检测到了所有标注成分，在三个商品样本中检测到了当归、防风、红花等药材成分，还发现了防风的掺假物种，证明了NGS技术在中药复方质量控制中的可行性。

2.3 加工后中成药产品成分检测

中成药产品通常经过高温、研磨、提取等深加工工序，使得DNA发生严重降解，给鉴定带来巨大挑战。针对这一问题，研究人员开发了接头连接介导PCR（adaptor ligation-mediated PCR）通用方法，在浓缩中药颗粒中成功扩增出不同长度的ITS2区域DNA片段，可用于鉴定浓缩颗粒中的目标物种，为深加工中草药产品的质量控制提供了新的解决方案。

2.4 中草药中污染微生物检测

NGS技术在检测中草药中污染微生物方面也具有重要应用。使用鸟枪法宏条形码，研究人员在Wuhu San样本中鉴定出24个真菌属，包括Aspergillus（曲霉属）等潜在产毒真菌，展示了该技术在同时检测药材主成分和污染微生物方面的双重能力。这一应用对于全面评估中草药产品的安全性和质量具有重要意义。

2.5 不同测序技术的比较

Sanger一代测序、二代高通量测序和三代高通量测序在混合中草药鉴定中各具优劣。Sanger测序准确度高但通量低，适合单一药材鉴定；二代测序通量高、成本相对较低，适合大规模混杂样品分析；三代测序读长长，有助于解决序列拼接和复杂基因区域解析问题。选择何种技术取决于具体的研究目标、样品复杂度以及经费预算。

三、常用分子标记与引物序列

3.1 中草药DNA条形码常用分子标记

在中草药DNA条形码鉴定中，常用的分子标记主要包括以下几类。

核基因组的ITS2序列是目前应用最为广泛的条形码标记。陈士林研究团队在国际上首次验证了约220 bp的核基因组序列ITS2具有理想的物种鉴定能力，该序列长度适中、变异位点丰富、通用引物扩增成功率高，已成为中草药鉴定的首选分子标记。

叶绿体基因组上的rbcL、matK和psbA-trnH是国际通用的植物条形码候选序列。其中rbcL测序成功率最高，可达100%，扩增较为稳定；matK序列获得率相对较低，但具有较好的物种区分能力；psbA-trnH属于叶绿体基因间隔区，变异速率较高，在某些类群的鉴定中表现出良好效果。

3.2 常用引物序列

根据《中国药典》和国际通用的DNA条形码研究方案，常用的引物及其序列如下。

ITS2常见引物（扩增核糖体DNA内转录间隔区2）及其参考序列：