产品简介
GSTSep Glutathione Agarose Resin是一种GST标签蛋白纯化树脂,结构上以6%交联的琼脂糖凝胶为基质,通过12个原子的间隔臂,用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成。该设计使树脂的纯化效率得到了较大提高,使其每毫升基质可承载>20 mg GST融合蛋白(40 KDa)。此外,本品特异性好,性价比高,可以一步纯化各种表达系统中谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽重组衍生物。
GSTSep Glutathione Agarose Resin储存在含20%乙醇的1×PBS 中,填料和保护液的比例为1:1,我司官网规格为实际填料的体积。
GST标签蛋白纯化试剂盒 (琼脂糖树脂法)由GSTSep Glutathione Agarose Resin、优化预制的缓冲液、重力层析空柱组成,用于高效、快速纯化GST标签蛋白,为GST标签蛋白的纯化带来了极大的便利。
产品信息
类别 |
编号 |
组分名称 |
20753ES10 |
保存方式 |
翌圣货号 |
Part Ⅰ |
20753-A |
GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽琼脂糖树脂(用于GST标签蛋白纯化) |
10 mL |
2~8℃ |
20507ES |
20753-B |
1x PBS Buffer,PBS 缓冲液(粉末),PH 7.4,1L |
1 L |
RT |
60158ES |
|
20753-C |
1x TBS Buffer,TBS 缓冲液(粉末),PH 7.4,1L |
1 L |
RT |
60157ES |
|
20753-D |
Glutathione,Reduced(GSH) 还原型谷胱甘肽(GSH) |
2×1瓶 (307 mg/瓶) |
2~8℃ |
60342ES |
|
Part Ⅱ |
20753-E |
重力层析空柱,5 mL(50 μm) |
10×1套 |
RT |
20522ES |
储存条件
2~8℃保存,有效期2年。其中20753-B、20753-C、20753-D可室温保存。
使用说明
所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。
平衡/洗杂缓冲液:1x PBS Buffer,PBS 缓冲液(粉末),PH 7.4, 1L(20753-B), 使用时用蒸馏水或超纯水溶解,定容至1L即可。
10×GSH溶液:1x TBS Buffer,TBS 缓冲液(粉末),PH 7.4, 1L(20753-C), 使用时用蒸馏水或超纯水溶解,定容至1L。还原型谷胱甘肽GSH(20753-D),使用时取1瓶(307 mg)用10 mL 1x TBS Buffe溶解并混匀,即为10XGSH溶液。配制好的10XGSH溶液-20℃保存,一年有效。
洗脱缓冲液:按照9:1的比例混合适量1x TBS Buffer和10XGSH溶液。由于GSH在溶液中容易被氧化而失效,洗脱缓冲液宜新鲜配制,配制好的洗脱缓冲液4℃保存,两周内有效。洗脱缓冲液含10 mM GSH。
【注】平衡/洗杂缓冲液或洗脱缓冲液中可加入1-10 mM DTT。
【注】样品在上样前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤,减少杂质以防阻塞柱子。
1)细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达蛋白为例)
a. 挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
b. 表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000 rpm,离心15 min,收集菌体,然后加入1/10体积的平衡液和PMSF(Cat#20104ES)(PMSF在破碎前加入,其终浓度为1 mM),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,如蛋白酶抑制剂Cocktail(用于细菌提取)(Cat#20137ES),但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
c. 之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1 mg/mL。【注】如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE,可以不加入溶菌酶。
d. 将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。
e. 收集上述澄清蛋白液,10000 rpm,4℃离心20-30 min。取上清,0.22 µm/0.45 µm滤膜过滤后,置于冰上备用或-20℃保存。
2) 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶,5000 rpm离心10 min,收集上清。即可直接上柱纯化;【注】对于大量体积的上清,需加入硫酸铵进行沉淀浓缩,之后经平衡液透析后才能上柱。
1)取重力层析柱,5 mL(20753-E),装入下垫片,加入适量纯水润洗柱管和垫片,关闭下出口。
2)将GSTSep Glutathione Agarose Resin(20753-A)混合均匀,用枪头吸取适量浆液加入重力柱中(填料实际体积占悬液的一半),打开下出口流干保护液。
3)加入适量纯水冲洗填料,待柱管中液体重力流干后,关闭下出口。
4)加入润洗后的上垫片,确保垫片与填料之间没有空隙,且保持水平。
5)装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡,暂不使用时则加入保护液,4℃保存。
4.重力柱法纯化
1)将装填好GSTSep Glutathione Agarose Resin的重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下,重复2-3次。
2)将样品加到平衡好的重力柱中,样品保留时间至少2 min,保证样品和填料充分接触,收集流出液,可以反复上样增加结合效率。
3)用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。
4)用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱,分段收集,每一个柱体积收集一管,分别检测,既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱,又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
5)随后依次用3倍柱体积的平衡液和5倍柱体积的去离子水清洗填料。5倍柱体积的20%乙醇平衡填料,最后将填料保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。
5.SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。
GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生,但随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集,会造成流速和结合载量性能下降,此时需对填料进行清洗。
1)去除一些沉淀或变形物质
用2倍柱体积的6 M盐酸胍溶液进行清洗,然后立即用5倍柱体积的PBS,pH 7.4清洗。
2)去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积1% Triton X-100清洗,然后立即用5倍柱体积的PBS,pH 7.4清洗。
注意事项
Ver.CN20250109
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