产品简介

 

HisSep Ni-NTA Agarose Resin以交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni²⁺）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可或缺的树脂之一。

HisSep Ni-NTA Agarose Resin储存在含20%乙醇的1×PBS 中，填料和保护液的比例为1:1，我司官网规格为实际填料的体积。

His标签蛋白纯化试剂盒 (琼脂糖树脂法)由HisSep Ni-NTA Agarose Resin、优化预制的缓冲液、重力层析空柱组成，用于纯化各种表达系统表达的可溶性His标签蛋白，为可溶性His标签蛋白的纯化带来了极大的便利。

 

产品信息

 

类别	编号	组分名称	20751ES10	保存方式	翌圣货号
Part Ⅰ	20751-A	HisSep Ni-NTA Agarose Resin His标签蛋白琼脂糖纯化树脂	10 mL	2~8℃	20502ES
	20751-B	Lysis Buffer（5×）	100 mL	2~8℃	N/A
	20751-C	Wash Buffer（5×）	100 mL	2~8℃	N/A
	20751-D	Elution Buffer	200 mL	2~8℃	N/A
Part Ⅱ	20751-E	重力层析空柱，5 mL（50 μm）	10×1套	RT	20522ES

 

储存条件

 

2~8℃保存，有效期1年。

 

使用说明

 

1. 缓冲液配制

所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。

Lysis Buffer：Lysis Buffer（5×）（20751-B）, 使用时用蒸馏水或超纯水稀释成1×。

Wash Buffer：Wash Buffer（5×）（20751-C）, 使用时用蒸馏水或超纯水稀释成1×。

Elution Buffer：Elution Buffer（20751-D），可直接使用。

缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱。HisSep Ni-NTA Agarose Resin可以用于可溶性蛋白和包涵体蛋白的纯化，此试剂盒搭配缓冲液只可用于可溶性His标签蛋白纯化。

2. 样品准备

【注】样品在上样前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤，减少杂质以防阻塞柱子。

1）细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达蛋白为例）

a. 挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。

b. 表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000 rpm，离心15 min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（Cat#20104ES）（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1 mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂（如蛋白酶抑制剂Cocktail（用于His-Tag蛋白纯化）, Cat#20135ES03），但不能影响目的蛋白与树脂的结合。

c. 之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1 mg/mL。【注】如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。

d. 将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

e. 收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃离心20-30 min。取上清，0.22 µm/0.45 µm滤膜过滤后，置于冰上备用或-20℃保存。

2) 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白

将细胞培养液转移至离心瓶，5000 rpm离心10 min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。 【注】对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。

3.  HisSep Ni-NTA Agarose Resin重力柱的装填

1）取重力层析柱，5 mL（20751-E），装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。

 2）将HisSep Ni-NTA Agarose Resin（20751-A）混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入重力柱中（填料实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。

3）加入适量纯水冲洗填料，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。

4）加入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之间没有空隙，且保持水平。

5）装填好的重力柱可以直接加入Lysis Buffer进行平衡，暂不使用时则加入保护液，4℃保存。

     4. 重力柱法纯化

1）将装填好HisSep Ni-NTA Agarose Resin的重力柱用5倍柱体积Lysis Buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2-3次。

2）将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min，保证样品和填料充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。

3）用10-15倍柱体积的Wash Buffer进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。必要时可以调整咪唑的浓度进行洗杂。

4）用5-10倍柱体积的Elution Buffer洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。

5）随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗填料。5倍柱体积的20%乙醇平衡填料，最后将填料保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

     5. SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

6. 填料清洗

当填料使用过程中发现填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1）去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类

使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20 min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液，清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1 M醋酸溶液，接触时间为1-2 h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后使用去离子水清洗10倍柱体积。

2) 去除离子作用结合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接触10-15 min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

7. 填料再生

His标签蛋白亲和纯化填料所带的镍离子不需要经常螯合去除和重新挂镍离子。当填料使用过程中发现颜色变浅，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：

1）使用5倍柱体积去离子水清洗填料；

2）使用5倍柱体积100 mM EDTA（pH 8.0）剥落镍离子；

3）使用10倍柱体积去离子水清洗填料；

4）使用0.5 M NaOH清洗5倍柱体积，停留10-15 min；

5）使用去离子水清洗填料，直至pH中性；

6）使用3-5倍柱体积100 mM NiSO4再生挂镍；

7）使用10倍柱体积去离子水清洗。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

 

注意事项

 

1. 请勿冷冻保存本产品。
2. HisSep Ni-NTA Agarose Resin使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。
3. 所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
4. 本产品仅作科研用途。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

 

Ver.CN20250109