RPA可冻干原料介绍
RPA可冻干原料介绍
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2026-09-22
RPA（Recombinase Polymerase Amplification，重组酶聚合酶等温扩增）是一种于2006年首次报道的核酸等温扩增技术，由英国Birmingham大学科学家开发。与qPCR依赖精确的温控循环不同，RPA在37-42℃的恒温条件下，仅需15-30分钟即可实现核酸分子的指数级扩增，灵敏度可达单拷贝水平（1-10 copies/反应）。
RPA的反应机理高度依赖三种核心酶的协同作用，理解每种酶的功能，是理解RPA可冻干原料体系的前提。
重组酶（Recombinase）
重组酶是RPA反应的"导航系统"。最常用的重组酶来源于T4噬菌体（gp32蛋白）或相关嗜热菌。重组酶在ATP和Mg²⁺的存在下，与寡核苷酸引物形成复合物。该复合物能够扫描双链DNA，当发现与引物序列互补的区域时，引发链置换反应（strand exchange），将引物定位到靶序列上。
单链结合蛋白（SSB）
单链结合蛋白（SSB）在RPA反应中负责稳定被引物置换出的单链DNA（ssDNA），防止其重新配对形成二级结构（如发卡结构）或与亲本链重新退火。SSB的存在确保了引物延伸的顺畅进行。SSB与重组酶之间存在竞争关系——SSB过强会阻碍重组酶扫描DNA，SSB过弱则无法有效稳定ssDNA，导致扩增效率下降。最优的SSB浓度需要通过实验筛选确定。
DNA聚合酶
RPA通常使用具有强链置换活性的B型DNA聚合酶。该酶在引物3'端进行延伸，通过链置换机制推动前方的双链DNA结构，完成扩增。与Taq酶不同，Bsu polymerase的最适温度为30-37℃，属于中等温度偏好的酶，这一温度特性与RPA的等温扩增体系天然匹配。
为什么RPA原料需要可冻干版本?
常规RPA试剂以液体形式提供，储存于-20℃或2-8℃。对于POCT应用场景，液体试剂面临几个现实问题：需要冷链运输和储存，增加了配送成本；用户需要自行配制反应体系，操作步骤较多；效期受储存温度影响大，高温环境下稳定性下降。可冻干版的RPA试剂解决了这些问题；冻干状态下酶的化学稳定性显著提高，有效期可达室温储存12个月以上。对于宠物医院POCT（猫瘟/犬细小病毒检测）、食品安全快速检测（沙门氏菌、李斯特菌）、野外病原体筛查等应用，RPA可冻干原料都是核心技术支撑。
可冻干RPA原料的质量评价标准有哪些？
灵敏度验证（LOD测试）
使用已知拷贝数的标准品（基因组DNA或质粒标准品），以10倍梯度稀释法测定冻干RPA试剂的LOD。建议测试范围1-1000 copies/反应，要求LOD应≤100 copies/反应（以质粒标准品为参考）。批间LOD差异：不同批次冻干品对同一标准品的LOD偏差应≤1个数量级（10倍以内）。
扩增效率验证
比较冻干前后RPA体系的扩增曲线：冻干后Ct值偏移应≤2个循环；扩增曲线形态（荧光强度上升速率、曲线光滑度）应与冻干前相近。
储存稳定性验证
将冻干RPA试剂在推荐储存条件下（通常2-8℃或25℃）放置30天和60天后，取样进行功能性验证。要求：30天储存后灵敏度下降≤1个数量级；Ct值偏移≤1.0。
加速老化测试（37℃，7天）作为批间快速筛查方法：37℃/7天后，关键性能指标（LOD、Ct值）应无显著恶化。
引物兼容性验证
使用3-5对不同引物（涵盖不同GC含量38%-62%、不同长度35-50 nt、不同目标区域）测试冻干RPA对不同靶标的扩增适应性。要求：所有测试引物对均能产生阳性扩增（灵敏度满足要求）；不同引物对之间的Ct值差异应在合理范围内
翌圣生物可提供RPA等温扩增体系所需的核心可冻干酶原料，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的优化冻干混合物，经功能性验证，冻干后扩增性能稳定，支持宠物诊断试剂开发企业客户的RPA冻干试剂盒开发。
对于有特定应用体系开发需求的客户，翌圣可配合进行RPA冻干原料在特定应用场景中的适配性评估，包括样本类型兼容性（粪便、全血、血清等）、引物探针设计优化建议、以及冻干工艺可行性评估。
翌圣生物相关产品
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产品货号 |
定位 |
应用场景 |
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冻干保护剂 |
冻干试剂制备 |
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Bsu DNA polymerase（Large fragment），不可冻干 |
RPA液体试剂 |
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T4 UvsX Recombinase，不可冻干 |
RPA液体试剂 |
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T4 UvsY Recombinase，不可冻干 |
RPA液体试剂 |
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T4 gene 32 Protein（gp 32），不可冻干 |
RPA液体试剂 |
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肌酸激酶Creatine Kinase，不可冻干 |
RPA液体试剂 |
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Exonuclease III，不可冻干 |
RPA液体试剂 |
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荧光型RPA mix（Exo探针法） |
RPA液体试剂 |
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16708 |
荧光型RT-RPA mix（Exo探针法） |
RT-RPA液体试剂 |
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16725 |
层析型RPA mix（Nfo探针法） |
RPA液体试剂 |
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16726 |
层析型RT-RPA mix（Nfo探针法） |
RT-RPA液体试剂 |
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16727 |
电泳型RPA mix |
RPA液体试剂 |
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16728 |
电泳型RT-RPA mix |
RT-RPA液体试剂 |
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16904 |
荧光型RPA （Exo探针法）（原位冻干粉） |
RPA冻干粉 |
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16905 |
荧光型RT-RPA（Exo探针法）（原位冻干粉） |
RT-RPA冻干粉 |
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16906 |
层析型RPA （Nfo探针法）（原位冻干粉） |
RPA冻干粉 |
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16907 |
层析型RT-RPA（Nfo探针法）（原位冻干粉） |
RT-RPA冻干粉 |
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16908 |
电泳型RPA （原位冻干粉） |
RPA冻干粉 |
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16909 |
电泳型RT-RPA （原位冻干粉） |
RT-RPA冻干粉 |
