干货丨PCR替代方案：RPA重组酶聚合酶扩增技术常见问题解答（FAQ）
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是Piepenburg等人在2006年利用重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶等开发出的一种新的核酸恒温扩增技术。该技术能够在10~30 min内进行恒温（37~42℃）下的单分子核酸检测，有望成为聚合酶链式反应 (PCR) 替代方案。
下面，小翌就带领大家一起盘点一下RPA常见实验技术问题。
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多酶协作体系：包括重组酶（如UvsX）、辅助蛋白（如UvsY）、单链DNA结合蛋白（GP32）及链置换DNA聚合酶（如Bsu）等。
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恒温扩增：37-42℃反应3-20 min，无需热循环仪。
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样本兼容性强：检测灵敏度可达单个拷贝和数十个拷贝，而且样本耐受性广泛，在某些情况下可以直接处理未经核酸纯化处理的复杂样品，比如血液、鼻拭子或培养基等。
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适用模板广泛：可检测DNA或RNA模板。
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引物设计：引物长度建议为30-35个核苷酸，过短可能降低反应速度和灵敏度，引物过长（45 nt）会增加二级结构的可能性。
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产物长度：扩增产物建议在100-250bp之间。
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加样顺序：模板和醋酸镁最后加入，避免非特异性扩增和反应提前启动。
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混匀充分：确保反应体系均匀。
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产物处理：电泳前建议用蛋白酶K处理或纯化产物，避免杂质干扰检测。
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仪器设置：PCR仪、qPCR仪需确保关闭热盖，可以提前选择关闭热盖选项后运行程序使得热盖开始降温。一般PCR仪、qPCR仪打开电源后热盖会马上升温直到105℃，虽然选择了关闭热盖，但是热盖温度已经是105℃，因此需要确保热盖温度降到合适的温度，例如在50℃以下才可以把反应管放进去反应，否则热盖温度传导到底部，可能会导致酶部分失活或全部失活。
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靶标区域的选择：GC 含量40%-60%。
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引物设计：引物长度30-35；引物GC含量 30%-70%；引物Tm值50-70。
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序列结构优化：避免重复序列，最大重复碱基数为5；5’末端应避免连续G，最好是胞嘧啶，可以促进片段重组；3’末端最好是GC，可以提高扩增性能。
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扩增区域长度：80-500 bp，100-200 bp较为理想。
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避免二级结构：引物设计时应尽量避免易形成二级结构或发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。
建议使用电泳法进行引物初筛，随后根据靶标序列设计探针，使用荧光型试剂盒，可以读荧光数值，进行量化，并且可以同时做多个条件，更适合探索优化实验条件，筛选引物和探针。此外，试纸型试剂盒，和荧光型设计原理高度相似，在荧光型的引物探针基础上，比较容易得到好用的引物组和探针。
不适用。Taqman探针依赖Taq DNA聚合酶的5’到3’外切酶活性实现荧光信号释放，而RPA体系中所用Bsu DNA聚合酶不具备该活性。
由于反应体系中含有较多的蛋白酶及大分子物质，会导致堵孔，上样前需进行产物纯化。
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污染风险：高拷贝（≥10^6 copies/μL）的模板，容易造成气溶胶污染；
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实验分区：样本制备区/试剂准备区/加样区/反应区等尽可能做到分区；
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环境清洁：每次试验前后或者步骤之间对空气和工作区以及移液器，要用核酸清除剂或10%漂白剂消毒清除气溶胶污染；
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减少产物开盖次数。
RPA反应在室温下即可启动，若提前加入激活剂（如醋酸镁），极易引发非特异性扩增或底物提前消耗。因此，建议模板与激活剂最后加入，以控制反应起始时机，提高特异性与重复性。
推荐使用FAM通道（羧基荧光素）进行检测，吸收波长为492 nm，发射波长为518 nm。
RPA（重组酶聚合酶扩增，Recombinase Polymerase Amplification)与 RAA (重组酶介导的扩增技术，Recombinase Aided Amplification) 本质为同一种恒温扩增技术，只是名称表述不同。
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共同点：均使用了重组酶、单链DNA结合蛋白以及DNA聚合酶等多种酶的协同作用，以实现高效的核酸扩增。
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不同点：重组酶的来源不同，RPA的重组酶来源于T4噬菌体；RAA的重组酶来源于细菌或者真菌。
（1）（PCR）Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是从水生噬热杆菌(Thermus aquaticus)中提取获得的热稳定DNA聚合酶，可以DNA作为模板合成DNA。因其出色的热稳定性，可结合温度循环变换过程，在体外完成DNA的复制。目前体外诊断试剂常用具有热启动(Hot start)功能的Taq DNA聚合酶，该类酶通过修饰抑制其在低温条件下的活性，防止其在未达到预设温度时出现非特异性扩增，只有在温度升高后，解除抑制，才释放酶活性，从而进入PCR循环扩增过程。
（2）（LAMP）Bst DNA聚合酶
不同于PCR反应需要反复的热变性以解开DNA双链，在应用上依赖于高质量的热循环仪。自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的DNA等温扩增技术，其中相当一部分是利用链置换反应解开DNA双链模板。链置换反应是指某些DNA聚合酶在延伸新链的过程中如果遇到下游DNA链，可以继续延伸反应并同时将下游双链剥离而产生游离的单链。
其中LAMP体系，常用的链置换DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶，这种酶具有5'→3' DNA聚合酶活性，不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。Bst DNA Polymerase具有很强的链置换(strand displacement)能力，可应用于核酸的等温扩增反应，如环介导的等温扩增和滚环扩增等。
（3）（RPA）相关酶
RPA技术是一种多酶协作的反应体系。重组酶可与引物结合形成复合体，定位至与引物同源的靶序列，促使引物与模板结合，同时帮助DNA解链，以便启动扩增；单链DNA结合蛋白(SSB)可与被置换出的DNA单链结合，稳定单链结构。Bsu DNA聚合酶也是链置换DNA聚合酶的一种，主要应用于RPA重组酶扩增，其与Bst DNA聚合酶相比，来源、最适反应温度、链置换活性的强弱均不一样。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列；一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应，Bsu DNA聚合酶启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。
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电泳型（基础型），类似PCR，只是完成DNA/RNA扩增，用琼脂糖凝胶电泳观察结果或与CRISPR技术结合使用。
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荧光型，在基础型的基础上，引入荧光探针（Exo probe），类似荧光探针PCR。可以用荧光仪读荧光值。
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试纸型，在基础型的基础上，引入试纸探针（Nfo probe），可以用层析试纸条观察结果。
翌圣RPA产品选择指南
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产品大类 |
产品名称 |
产品货号 |
产品类型/作用 |
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RPA Kit （液体型） |
DNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） |
16702ES |
荧光型RPA Kit（Exo探针法） |
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RNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） |
16708ES |
荧光型RT-RPA Kit（Exo探针法） |
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DNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） |
16725ES |
层析型RPA Kit（Nfo探针法） |
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RNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） |
16726ES |
层析型RT-RPA Kit（Nfo探针法） |
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DNA Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) |
16727ES |
电泳型RPA Kit |
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RNA Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) |
16728ES |
电泳型RT-RPA Kit |
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RPA Kit （冻干粉） |
DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） |
16904ES |
荧光型RPA （Exo探针法）（原位冻干粉） |
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RNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） |
16905ES |
荧光型RT-RPA（Exo探针法）（原位冻干粉） |
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DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） |
16906ES |
层析型RPA （Nfo探针法）（原位冻干粉） |
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RNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） |
16907ES |
层析型RT-RPA（Nfo探针法）（原位冻干粉） |
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DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) |
16908ES |
电泳型RPA （原位冻干粉） |
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RNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) |
16909ES |
电泳型RT-RPA （原位冻干粉） |
