告别满板空载！小牛肠碱性磷酸酶 CIAP 高效脱磷解决方案

分子克隆是分子生物学领域最基础、使用频次最高的核心实验手段，重组质粒构建、基因敲除载体搭建、文库筛选等各类实验，成败关键都取决于载体与外源片段的连接效率。

但绝大多数科研人员都曾遇到同款实验困境：完整走完酶切、连接、转化、涂板全套流程，满心期待培养结果，最终平板上却遍布空载自连菌落，真正插入目的片段的阳性重组克隆寥寥无几。后续菌落 PCR 筛选、测序验证不仅耗费大量时间人力，还会浪费珍贵实验样本与试剂。

造成高背景克隆的核心症结十分明确：线性化载体两端携带 5′磷酸基团，在 T4 DNA 连接酶作用下极易发生载体自身环化，且载体自连效率远高于外源片段插入连接。因此，对线性化载体做去磷酸化处理，是压低克隆背景、提升阳性克隆检出率的核心解决方案。

图1. 去磷酸化过程影响载体自连示意图

在各类核酸去磷酸化工具酶中，小牛肠碱性磷酸酶（Calf Intestine Alkaline Phosphatase, CIAP）凭借悠久应用历史与稳定性能，成为分子克隆领域公认的标杆试剂。

翌圣生物小牛肠碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase (30 U/μL), Calf Intestine (CIAP)，货号 Cat#10321ES），从酶蛋白纯度、酶活均一性、核酸酶残留控制三大核心维度建立严苛内控标准，为科研工作者提供批次稳定、结果可重复的载体去磷酸化专用工具。

产品特性

翌圣 CIAP 来源于酵母重组表达，可非特异性催化 DNA 和 RNA 的5′端及3′端磷酸单酯水解，释放无机磷酸并暴露出羟基末端。此外，该酶还可高效水解核苷三磷酸（NTP）和脱氧核苷三磷酸（dNTP），适用于测序及 SNP 分析样本中残留 dNTPs 的清除。

在分子克隆的典型操作流程中，推荐的工作条件为：37 ℃ 孵育 30 分钟进行去磷酸化反应，随后加入 5 mM EDTA 并于 60 ℃ 处理 30 分钟以终止反应。EDTA 通过螯合酶活性所必需的锌离子和镁离子实现彻底灭活，确保后续连接反应不受干扰。

数据展示

热灭活效果优异，无残留酶活干扰

以 pNPP 为底物检测酶活，实验组添加 5 mM EDTA 后 65 ℃处理 30 min，酶活几乎完全消失，不会残留磷酸化活性影响下游实验。

图2. 翌圣 CIAP 热灭活条件验证

蓝色曲线：未灭活对照组；红色曲线：5 mM EDTA+65 ℃处理 30 min 实验组

性能验证：去磷酸化后显著提升阳性克隆占比

单酶切转化验证：pUC19 质粒经 HindIII 单酶切线性化，使用翌圣 CIAP 37 ℃脱磷 30 min，EDTA 65 ℃灭活 30 min，T4 连接酶连接后转化 DH5α 感受态细胞。结果显示CIAP 处理组平板菌落数量远低于未脱磷阴性对照组，载体自身环化被显著抑制，空载背景大幅减少。

图3. 翌圣 CIAP 单酶切（HindIII）去磷酸化抑制载体自连验证

性能验证：双酶切去磷酸化后阳性克隆率显著提升

双酶切转化验证：以 pUC19 质粒经 HindIII/NdeI 双酶切线性化，翌圣 CIAP 去磷酸化处理后，与 332 bp 外源 PCR 片段连接并转化 DH5α。从平板随机挑取 11 个单克隆，利用pUC19特异性引物进行菌落PCR验证。结果显示CIAP 处理组空载背景转化子数量明显下降，阳性重组克隆检出率大幅提升。

图4. 翌圣 CIAP 双酶切（HindIII/NdeI）去磷酸化后阳性克隆率验证

极低核酸酶残留，杜绝底物降解干扰

将翌圣 CIAP 分别与 DNA、RNA 底物共孵育，琼脂糖凝胶电泳结果显示核酸条带完整清晰、无弥散降解拖尾。证明本品 DNase、RNase、核酸外切酶、切口酶残留水平极低，充分保障核酸底物完整性，实验结果稳定可靠。

图5. 翌圣 CIAP 核酸外切酶、非特异核酸外切酶、DNase 和 RNase 残留检测结果

多元应用场景：不止于克隆

CIAP 最核心用途为分子克隆载体去磷酸化，通过去除线性载体 5′端磷酸基团阻断自连，降低克隆背景、提高重组阳性率；除此之外，还可覆盖多类分子、生化实验：

• 测序与 SNP 分型样本制备：降解 PCR 产物中残留 dNTP，避免游离 dNTP 干扰后续一代测序、单碱基延伸分型反应；
• 核酸末端标记前处理：DNA/RNA 放射性、荧光标记前，使用 CIAP 去除核酸原有末端磷酸，再通过 T4 PNK 引入标记磷酸，是经典末端标记实验标准流程；
• 蛋白磷酸化机制研究：可水解蛋白丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸位点磷酸基团，用于磷酸化蛋白 WB 前处理、蛋白磷酸化调控通路探究。

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为满足不同实验场景的需求，翌圣生物提供系列碱性磷酸酶产品：