PCR 扩增后电泳没有条带，是什么原因？

原因 1：反应体系不佳 （1）引物问题 ①引物设计不合理：使用 NCBI Blast 验证，遵循引物设计原则； ②引物降解：琼脂糖或 PAGE 电泳检测引物，判断是否降解。 （2）模板问题 ①模板纯度低：样品内抑制物抑制 DNA 聚合酶活性，造成扩增失败； ②模板降解：模板完整性破坏，缺少完整扩增模板； ③模板用量不当：用量过低，产物低于凝胶成像检出下限；用量过高，带入更多抑制物，且模板自身复性，竞争性抑制引物结合。 优化：梯度稀释模板，使用推荐上样量；电泳 + OD 评估模板质量，模板质量差则重新制备。 模板质控：OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8–1.9，OD₂₆₀/OD₂₃₀＞2.0；电泳条带单一，严重拖尾抹带提示模板降解。GC 过高 / 过低可添加 PCR 增强剂或加长引物。 原因 2：反应程序不佳 （1）退火温度过高：引物难以与模板结合。退火温度一般低于引物 Tm 值 3–5 ℃；可在 48–65 ℃设置梯度 PCR，寻找最优退火温度。 （2）延伸时间不足：长片段、低浓度、复杂模板可适当延长。延伸不足，产物无法完整合成。 （3）循环次数不足：推荐 30–40 循环；模板量偏低时可调整至 35 个循环，提升产物量。 原因 3：操作与成像误差 （1）体系漏加组分或 PCR 程序设置错误。复测，核对体系组分与程序参数。 （2）凝胶成像仪器选择不匹配：EB/YeaRed/GelRed 适合紫外成像仪；YeaGreen 主激发 471 nm，优先蓝光透射仪，紫外仪也可使用但信号偏弱。染料与成像仪不匹配会看不到条带或条带极弱。