新城疫的背景、采样方法、检测方法以及 RT-qPCR的提取+PCR实验步骤以及检测优势

2026-11-06

新城疫背景

PART ONE

新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一种急性、高度接触性、烈性传染病，主要侵害鸡、火鸡、鸽子等禽类，不分品种、年龄均可感染，其中雏禽发病率和病死率极高（可达90%以上），成年禽多表现为呼吸道症状、产蛋下降，康复后生长发育受阻，给养禽业造成巨大经济损失。

NDV属于副黏病毒科副黏病毒属，为单股负链RNA病毒，具有囊膜，对外界环境抵抗力较强，在低温、潮湿环境中可存活数周，对热、酸、碱及常用消毒剂敏感。该病毒主要通过呼吸道、消化道传播，也可通过接触传播，病禽的粪便、分泌物、呼吸道飞沫均为主要传染源，一旦在禽群中暴发，可快速扩散，目前新城疫被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，也是我国重点防控的禽类疫病之一。

采样方法

PART TWO

采样的核心是保证样品新鲜、无污染、有代表性，避免因采样不当导致检测结果假阴性或假阳性，为精准诊断提供可靠依据，具体方法如下：

1、采样时机

优先采集发病初期（发病1~3天内）出现典型症状的病禽，此时病禽体内病毒载量最高，检测准确率最高；避免采集病程后期、已康复或濒死期的禽只，同时采集同群健康禽只作为对照。

2、采样部位及方法

呼吸道样品：

用无菌棉签擦拭病禽咽喉部、气管黏膜，轻轻旋转采集分泌物，将棉签放入含无菌生理盐水的离心管中，折断棉签杆，做好标记（禽只编号、采样日期、采样部位）。

消化道样品：

采集病禽新鲜粪便（约3~5g），用无菌采样勺采集，避免接触垫料、土壤等污染物，放入无菌离心管中；或解剖病禽，采集小肠、盲肠内容物（约2g），放入无菌冻存管。

组织样品：

对病死禽，无菌操作下解剖，采集肺、脾、肝、脑、气管等组织（各约1~2g），去除杂质，放入无菌冻存管，做好标记。

血清样品：

对存活病禽，翅静脉采血2~3ml，放入无菌离心管中，室温静置2~4小时，4℃、3000r/min离心10分钟，吸取上层血清，转移至新的无菌离心管，用于血清学检测。

3、样品保存与运输

采样后立即置于4℃冷藏（短期保存，不超过24小时），如需长期保存，放入-80℃冷冻，避免反复冻融；运输时用保温箱，加入冰袋，确保样品全程低温，同时附样品信息单，注明采样地点、禽群规模、发病情况、症状等，避免样品混淆或污染。

检测方法

PART THREE

目前新城疫的检测方法主要分为血清学检测、分子生物学检测、病原学检测三大类，各有优劣，可根据检测目的、实验条件选择合适方法，具体如下：

1、血清学检测

主要检测病禽血清中的NDV特异性抗体，用于回顾性诊断、免疫效果评估、禽群抗体水平监测，常用方法包括：

酶联免疫吸附试验（ELISA）：

操作简便、快速，可批量检测，适合大规模禽群抗体筛查，是目前养禽业常用的血清学检测方法。

血凝抑制试验（HI）：

特异性高，可定量检测血清中的中和抗体，用于评估疫苗免疫效果和病毒毒力测定，是经典的血清学检测方法。

中和试验（SN）：

准确度高，可检测血清中能中和NDV的特异性抗体，用于疫苗保护力评价，但操作繁琐、耗时较长，多用于实验室研究。

优势：操作相对简便、成本较低，可批量检测；

劣势：检测的是抗体，发病初期（感染后7~10天内）抗体未产生，易出现假阴性，无法用于早期诊断。

2、分子生物学检测

主要检测NDV核酸（RNA），用于早期诊断、快速筛查，灵敏度和特异性均高于血清学检测，是目前临床和实验室最常用的检测方法，常用方法包括：

RT-PCR：

通过逆转录将RNA转化为cDNA，再进行PCR扩增，电泳检测条带判定结果，可定性检测NDV，操作相对简便。

RT-qPCR（实时荧光定量RT-PCR）：

将逆转录与实时荧光定量PCR结合，可定性+定量检测NDV，灵敏度最高、特异性最强，是目前临床首选的快速检测方法。

恒温扩增技术（LAMP/RPA）：

需精密PCR仪，操作简便、快速，适合基层现场快速检测，可在1~2小时内出结果。

3、病原学检测

主要检测病料中的活病毒，用于病毒分离、鉴定、毒株保存和疫苗研发，常用方法为病毒分离培养法（金标准），通过接种易感细胞（如鸡胚、Vero细胞），观察细胞病变或鸡胚死亡情况，分离获得活病毒，但操作复杂、耗时较长（需3~7天），不适合常规快速检测。

RT-qPCR的核酸提取+PCR实验步骤

PART FOUR

RT-qPCR（实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应）是将逆转录（RT）与实时荧光定量PCR结合，可快速、精准检测NDV核酸，核心分为核酸提取和PCR扩增两步，操作标准化，适合实验室和规模化养禽场检测，具体步骤如下（以呼吸道样品为例）：

1、核酸提取（Trizol法，经典常用）

以下以翌圣（Yeasen）试剂为例演示标准操作：

推荐试剂：MolPure® Magnetic Universal Viral DNA/RNA Kit (Cat#18521ES)

裂解释放：

取200μL血清或组织匀浆上清，加入裂解结合液、蛋白酶K与磁珠，涡旋混匀，50℃振荡温浴5~7min。磁珠表面的特异性涂层将高效捕获病毒RNA。

洗涤除杂：

置于磁力架上吸附磁珠，弃上清。依次加入洗涤液A和洗涤液B，充分重悬磁珠后再次吸附弃液，彻底去除蛋白、抑制剂及杂质。

洗脱收集：

加入无核酸酶水洗脱液，60℃加热洗脱5 min，磁性分离后收集上清液，即为高纯度病毒RNA，可直接用于qPCR。获得NDV RNA溶液，-80℃保存备用。

2、RT-qPCR实验步骤

试剂准备：提前将RT-qPCR试剂盒（含逆转录酶、Taq酶、NDV特异性引物、探针、反应Buffer等）从-20℃取出，室温解冻，轻轻混匀，4℃短暂离心，避免试剂沉淀。

推荐试剂：Hifair® C203P1 Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG Plus)二代通用、高灵敏RT-qPCR预混液 (Cat#16630ES)

注：模板RNA和引物探针（Primer Mix和Probe Mix）需要自备。

体系配制（以25μL体系为例）：

上机扩增程序：

结果判定：设置阳性对照（已知NDV阳性RNA）、阴性对照（DEPC水）、空白对照（无模板），若样品Ct值≤35，且溶解曲线单一（无杂峰），判定为阳性；Ct值＞35或无Ct值，判定为阴性；阳性对照Ct值正常、阴性对照无Ct值，实验才有效，否则需重新检测。

3、注意事项

（1）全程严格无菌操作，实验器具可以用DEPC水浸泡处理，操作人员戴手套、口罩，避免RNA酶污染导致RNA降解；

（2）RNA易降解，全程低温操作，避免反复冻融；

（3）引物、探针需低温保存，配制时严格按照比例，避免浓度偏差；

（4）反应体系配制需在冰上进行，避免酶失活，影响扩增效果；

（5）实验分区操作（试剂配制区、模板区、扩增区），避免气溶胶污染导致假阳性。

RT-qPCR检测优势

PART FIVE

相比血清学检测、常规RT-PCR、病毒分离培养等方法，RT-qPCR检测NDV具有显著优势，是目前临床诊断、疫情筛查的首选方法，具体优势如下：

灵敏度高：

可检测到极低浓度的NDV RNA（最低检测限可达10 copies/μl），发病初期（感染后1~2天）即可检测到病毒，避免漏检，适合早期诊断和疫情筛查，尤其适合隐性感染禽只的检测。

特异性强：

采用NDV特异性引物和探针，仅与NDV核酸特异性结合，不与其他禽类病毒（如禽流感病毒、传染性支气管炎病毒）发生交叉反应，检测结果准确，减少假阳性。

快速高效：

整个实验流程（核酸提取+PCR扩增）仅需3~4小时，可批量检测（一次可检测96个样品），相比病毒分离（3~7天）、血清学检测（需等待抗体产生），大幅缩短检测时间，便于快速采取防控措施。

定量准确：

可通过Ct值定量分析病禽体内的病毒载量，判断病情严重程度，同时可用于评估防控效果和疫苗免疫后的病毒清除情况，为精准防控提供依据。

操作简便：

无需复杂的实验技术，流程标准化，经过简单培训即可操作，所需仪器（RT-qPCR仪）在各级兽医实验室、规模化养禽场均可配备，适用性广。

适用范围广：

可检测呼吸道分泌物、粪便、组织等多种样品，对不同年龄段、不同品种的禽只均适用，可用于疫情筛查、临床诊断、免疫监测等多种场景。

综上，RT-qPCR凭借灵敏度高、特异性强、快速高效等优势，已成为新城疫防控中最核心的检测技术，结合规范的采样方法和背景认知，可有效实现ND的早期诊断和精准防控，减少养禽业经济损失。

翌圣检测相关产品推荐表

货号	产品名称	核心特点
18521ES	MolPure® 磁珠法通用病毒DNA/RNA提取试剂盒	兼容全血/血清/拭子等多类样本；磁珠法纯度高；支持手工及自动化提取。
16930ES	Hifair® Universal Advanced Multiplex One Step RT-qPCR Mix (UDG Plus) 三代通用、高灵敏、耐抑制RT-qPCR预混液	通用性强；dUTP/UDG 防污染系统；支持快速程序<35 min。
16983ES	Hifair® Multiplex Superfast One Step RT-qPCR Probe Mix（UDG Plus）	支持快速程序；dUTP/UDG 防污染系统。
16921ES	Hifair® Advanced One Step RT-qPCR Probe Mix (UDG Plus) 高灵敏高乘数（5×）RT-qPCR预混液（一管式）	高灵敏高乘数（5×）；dUTP/UDG 防污染系统。
13650ES	Hifair® V C58P2 Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG Plus)一代通用RT-qPCR预混液	灵敏度低至250 copies/mL；dUTP/UDG 防污染系统；支持快速程序40 min。
16913ES	Hifair® Superpro Fast One Step RT-qPCR Master Mix (UDG Plus) 二代快速、全预混RT-qPCR预混液	全预混（酶和buffer一管）；支持40min快速程序；dUTP/UDG 防污染系统；引物探针提前预混，37℃放置5天性能稳定。
11899ES	Hifair® Superpro Ⅱ One Step RT-qPCR Master Mix 一代通用、全预混RT-qPCR预混液	全预混（酶和buffer一管）；更适合常规1h的程序；引物探针提前预混，37℃放置5天性能稳定；dUTP/UDG防污染体系。
80512ES	AP-16S 16通道全自动核酸提取仪	16通道同步提取；磁棒套防交叉污染；操作简便，适合中小型实验室高通量需求。
80511ES	AP-48S 48通道全自动核酸提取仪	48通道同步提取；磁棒套防交叉污染；操作简便，适合中小型实验室高通量需求。
80510ES	AP-96S 96通道全自动核酸提取仪	96通道同步提取；磁棒套防交叉污染；操作简便，适合大型实验室高通量需求。