WB实验指南：蛋白转膜操作指南及注意事项

2026-05-08

蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是一种常用于蛋白质分析的技术手段，其核心流程包括通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品进行分离，随后将蛋白转移至固相膜上，并利用特异性抗体（通常为一抗与二抗的复合物）对目标蛋白进行检测。该方法因其高灵敏度和良好的特异性，已成为生命科学研究中应用最广泛的蛋白检测技术之一。

蛋白转膜是将经过SDS-PAGE凝胶电泳分离的蛋白质进一步转移到固相膜上的关键步骤，为后续的抗体杂交做准备。这种方法主要有湿转和半干转两大类。本文以湿转为例对转膜步骤涉及到的操作步骤、试剂选择及常见问题进行详细介绍。

一、操作步骤

1.配置好转膜缓冲液：提前配好转膜液，并在4℃冰箱预冷，以应对转膜过程产热。或使用不需要冰浴的转膜液进行实验。

货号	20329ES	36123ES	36131ES
名称	Western blot电泳电转通用缓冲液	10×快速转膜液	快速转膜液（1×，预混粉末）
规格	10×1 L；50×1 L	500 mL	10包/袋 50包/盒
提供形式	粉末	液体	粉末
组分（1x）	25 mM Tris、192 mM Glycine、0.1% SDS	暂不公开
使用方法	加入20%乙醇即得到湿转或半干转通用转膜缓冲液	10×快速转膜液：去离子水：无水乙醇按1:8:1比例配制成1×快速转膜液，能在15-35分钟内快速完成转膜，无需额外冰水浴	快速转膜液的配制:向粉末中加入约600mL去离子水溶解后，加入100 mL无水乙醇，混匀，最后加水定容至1L即可使用。
优缺点	可用于变性电泳缓冲液，转膜时产热量大，需冰浴，且有时SDS会造成小分子穿膜	能在15-35分钟内快速完成转膜，无需额外冰水浴

2.活化转印膜膜：PVDF膜使用前需在甲醇中充分活化，通常需要2 min。活化后，可放置于转膜缓冲液中平衡。NC膜不需要进行活化。根据目标蛋白分子量大小，选择合适的膜孔径移，（分子量小于20 kDa的蛋白时建议使用小孔径的膜，如0.22 μm；正常情况下使用0.45 μm孔径的膜即可)。

货号	36125ES	36126ES	36129ES	36130ES
名称	0.45 μm PVDF 膜	0.22 μm PVDF 膜	0.45 μm NC 膜	0.22 μm NC 膜
孔径	0.45 μm	0.22 μm	0.45 μm	0.22 μm
规格	1 卷，30 cm x 3.75 m或 25片，10×10cm
蛋白吸附能力	强		较强
甲醇活化	需要		不需要
机械强度	强，不易破碎		容易破损，对操作者要求较高
用途	适用于western blot，分子量大于20 kDa蛋白质的转印	适用于western blot，分子量小于20 kDa蛋白质的转印	适用于western blot，分子量大于20 kDa蛋白质的转印	适用于western blot，分子量小于20 kDa蛋白质的转印

3.切胶：小心撬开玻璃板，避免损坏凝胶。如果胶贴在玻璃板上特别紧可以倒点转膜液或电泳液润湿凝胶后会更容易分离，不要强硬分离容易使胶破损；切除浓缩胶，保留含有目的蛋白的凝胶部分。

货号

名称

产品图片

80838ES

预制胶开胶器

80822ES

剥胶铲

4.构建“转膜三明治”：将转膜夹、海绵以及滤纸全部浸入装有转膜缓冲液的托盘中，确保它们充分湿润。

在转膜夹的两面依次放置海绵和双层滤纸，将PVDF膜缓慢放置在滤纸上，再将凝胶转移到膜上，使其贴合，要确保两者之间没有气泡产生。这一步对于转膜效果至关重要。

最后，将转膜夹的两面合拢，并使用白色滑块锁定夹套，从而形成一个紧密的“转膜三明治”结构。从负极到正极的顺序依次是：海绵、滤纸、凝胶、转印膜、滤纸、海绵。

货号	名称	产品规格
80836ES	转印滤纸	1包（50张）
80847ES	免滤纸转印海绵	1包（10张）
80220ES	BlotⅠ迷你垂直转印槽	1套（包含外壳、上盖、转印框、转印夹、大孔海绵、制冷模块）
80311ES	EpPlus 增强型电泳仪电源	台

5.转膜：将“转膜三明治”插入转膜架并放入电泳槽；加入足够的转膜缓冲液，确保没过“转膜三明治”；盖上安全盖，接上电源开始电泳；根据目标蛋白分子量大小调整电压电流和时间。（我们一般横流转膜，转膜时间根据分子大小确定）转膜时会产热，为避免过热会在转膜的时放上冰块，冰上转膜。

6.检测转膜效率：若有需要，可试用丽春红染液对膜进行染色或者使用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，判断转膜是否充分。

货号	名称	规格
20308ES	考马斯亮蓝快速染色液(无需加热，10×)	25 mL（10×）
20309ES	考马斯亮蓝快速染色液（8分钟）	8 mL（125×）