环介导等温扩增（LAMP）是一种简单而高效的DNA扩增检测方法，以其快速、简单等特点，在疾病诊断、转基因食品检测等分子POCT领域应用越来越广泛。LAMP检测方法分为多种，包括比浊法、pH显色法、荧光染料法（如NHB、钙黄绿素、SYBR Green、Syto等）、荧光探针法等，以上所有的方法都会用到关键核心酶原料Bst DNA聚合酶。

LAMP技术核心酶—Bst DNA聚合酶的性质，包括聚合活性、链置换能力和稳定性，在LAMP技术的反应速度和准确性方面起着决定性的作用。

翌圣生物Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）是将缺少5′→3′外切核酸酶结构域的Thermophilic Geobacillus sp DNA聚合酶基因在E.coli中表达纯化而得。该Bst DNA聚合酶链置换能力强，具备高灵敏度、高扩增效率、高dUTP耐受性的优势，可广泛应用于基于等温扩增技术的病原体即时检测。

Bst  Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）灵敏度超高，低至5copies目的基因可测。模板量为飞克（fg）级别，且始终能比竞品更快达到阈值，扩增速率更快。

图1. 分别用翌圣Bst  Plus DNA Polymerase（橙色）和竞品N（灰色）、竞品T（蓝色）的Bst酶进行RT-LAMP反应，使用各自制造商推荐的最佳方案，扩增新冠病毒。结果表明，翌圣Bst  Plus DNA Polymerase始终能比竞品更快达到阈值，扩增速率更快。

使用Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）进行RT-LAMP反应，扩增新冠假病毒模板(20 copies/T)。在推荐反应方案中引入dUTP/UDG酶防污染系统，使用dUTP替换dTTP。对比全U（35 mM）替换（红色扩增曲线）与T：U = 1：1（蓝色扩增曲线）的扩增结果发现，在反应体系中添加dUTP对Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase的灵敏度及扩增效率无影响，该酶具有较高的dUTP耐受性。

图2. 翌圣Hieff^® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）高dUTP耐受性验证结果

翌圣生物持续专注于分子酶的改造研究，通过高通量筛选平台获得了Bst Plus DNA Polymerase，该酶以其优异的灵敏度和抗抑制性能在新冠期间发挥重大作用。同时通过蛋白平台的持续研发工作，开发了WS Bst DNA Polymerase（Cat#14412ES），该酶是在Bst Plus DNA 聚合酶的基础上采用可逆性适配体修饰技术获得的温启动等温扩增聚合酶，能够在室温下完全封闭酶的活性，防止非特异性扩增，提高反应效率，可在室温下建立反应，更适合高通量、大规模筛选场景。另外，该温启动Bst聚合酶不需要单独的激活步骤，在>60℃时1min内完全释放酶活。

使用温启动Bst酶（Cat#14412ES）配置的RT-LAMP预混液16729（蓝色）、16730（无甘油，黑色），和市面上同类产品Supplier A（红色）同时扩增，结果显示：在不同体系下，16729/16730的扩增性能与Supplier A无显著差异，且特异性更好。

图3. 使用14412ES配置的LAMP体系与同类产品扩增性能比较

使用温启动Bst酶（Cat#14412ES）配置成荧光染料法的LAMP试剂，选择特异性一般的猫细小病毒引物，进行LAMP扩增，结果显示：适配体修饰的温启动Bst酶能在室温下抑制反应的进行，显示为本底信号低，非特异性扩增出峰时间晚于无适配体修饰的Bst酶在常温和冰上配置的体系。

图4. 使用14412ES配置的LAMP体系与无适配体修饰的Bst酶配置的体系室温建立反应比较

目前LAMP反应推荐温度为60-65℃，在该温度下，存在靶标核酸模板变性不彻底，样本中存在的抑制剂难以被灭活等问题，从而可能造成模板利用率不高或模板被降解等现象，最终导致LAMP检测灵敏度受限。为了获得适用于更高温度LAMP/RT-LAMP实验的Bst DNA聚合酶，翌圣与苏州医工所和华东理工三方联合，通过ProStaB/FADS的高通量双功能酶分子改造平台，共同开发了耐热Bst DNA聚合酶 Super Bst DNA Polymerase(Cat#14410ES/14411ES)，提升了Bst DNA聚合酶在70℃高温RT-LAMP中的扩增性能，可为期望提升LAMP实验灵敏度和开发免提取LAMP/RT-LAMP产品的客户提供测试装。

通过改造Bst DNA聚合酶的热稳定性，相比Parent（母本），突变体Bst22的Tm值提高了2.9℃，且耐热Bst22酶（Cat#14410ES）搭配高温耐热MMLV逆转录酶（Yeasen Cat#14612ES）能耐受70℃高温RT-LAMP反应。

图5.耐热Bst DNA聚合酶突变体筛选

以gDNA为模板，搭配翌圣13762的buffer体系，考察14411在65℃和70℃的扩增能力。图a添加量为2ng/uL的模板，图b模板浓度梯度降低，结果表明：14411可耐受70℃的LAMP反应，且提高温度，检测Ct值显著缩小，表明耐热Bst酶可进一步提升体系的灵敏度。

图6. Bst酶14411灵敏度测试