酪酰胺信号放大(TSA)试剂盒(Fluorescein荧光标记)（60405ES）

酪酰胺信号放大（TSA）系统可用于检测荧光免疫细胞化学（ICC）、免疫组织化学（IHC）和原位杂交（ISH）技术中的低丰度靶点，可将信号灵敏度提高100倍。TSA荧光试剂盒使用辣根过氧化物酶（HRP）直接催化固定化酶周围的荧光基团共价沉积，该标记过程迅速（小于10 min），沉积标记可直接在标准或共聚焦显微镜下观察。TSA试剂盒可与传统染色方法结合使用用于多色成像，也可以顺序进行两个或更多个酪酰胺反应以标记一个样品上的不同靶标。

TSA技术可用于酶缀合物和合适的生色底物的明场显微镜检查，也可以与抗荧光素酶结合物组合使用。与普通实验相比，使用TSA试剂可显著提高信号灵敏度，同时保持稳定的特异性和分辨率。此外，TSA试剂盒可以显著减少一抗或探针的消耗量。

Yeasen酪酰胺信号放大（TSA）系列产品包括三款试剂盒：试剂盒60405ES荧光标记信号为fluorescein，在激发和发射波长494 nm/517 nm下显微检测信号；试剂盒60406ES荧光标记信号为Cyanine 3，在激发和发射波长550 nm/570 nm下显微检测信号；试剂盒60407ES荧光标记信号为Cyanine 5，在激发和发射波长648 nm/667 nm下显微检测信号。

本试剂盒可使用100~300 sides。

组分信息

使用说明（仅供参考）

一. 自备试剂

(1) 1× PBS（Cat#41403ES）/1×D-PBS（Cat#60152ES）

(2) DMSO（Cat#60313ES）

(3) 多聚甲醛固定液（Cat#60536ES）

(4) Triton X-100（Cat#20107ES）

(5) 改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)（Cat#36319ES）

(6) 30% H₂O₂

(7) 一抗和HRP偶联的二抗

(8) 下列试剂仅用于Biotin-Tyramide系列实验：

a. 生物素封闭清洗缓冲液：含 1% BSA 和 0.05% Tween 20（Cat# 60305ES）的PBS

b. 未标记的链霉亲和素溶液：含 0.1 mg/mL 链霉亲和素的生物素封闭清洗缓冲液

c. 生物素溶液：含 0.5 mg/mL 生物素的生物素封闭清洗缓冲液。

^{以下参考步骤，可用于细胞或组织切片的酪酰胺染色，每个样品使用100 µL-300 μL 酪酰胺染色液（足以覆盖96孔板的一个孔或约1 cm2的组织部分），可以根据不同的样本尺寸增加或减少酪酰胺染色液的量。}

二. 溶液配制

1. 酪酰胺荧光储存液：组分B溶解于60 μL DMSO，配制成储存液，储存液置于2-8℃避光保存。

2. 酪酰胺荧光工作液：每次实验前，需要用组分A按照1:50-1:500的比例稀释酪酰胺荧光储存液，配置成含有0.3%的H2O2的酪酰胺荧光工作液（不同的实验目的，稀释比例需要进行调整以达到最优的结果）。每个载玻片大约需要100-300 μL的酪酰胺荧光工作液。

【注】保证配置酪酰胺荧光工作液用到的H2O2新鲜有效。每次实验操作结束以后，请丢弃未用完的酪酰胺荧光工作液。

3. 封闭缓冲液：可取组分C按照每1g溶于100 mL含0.5% Triton X-100 的PBS中的比例，配置成封闭缓冲液。组分C的用量根据实际情况进行取用，按照上述比例进行配置即可。

三、样本处理

1. 细胞样本

(1) 可选：准备一份阴性对照样本（不孵育一抗的样本）。

(2) 1×PBS清洗细胞两次。

(3) 细胞固定：加入适量 4%多聚甲醛固定液（pH 7.4），4℃放置15 min。

(4) 1×PBS清洗细胞两次。

(5) 通透细胞：用配制于PBS中的0.5% TritonX-100 溶液通透，室温放置10 min。或者加入冰上预冷的70%乙醇，在-20℃孵育4 h。细胞能在70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。

(6) 1×PBS清洗细胞两次。

2. 石蜡组织切片

(1) 将石蜡切片放置在60℃的烘箱中30 min。

(2) 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次，每次5 min，以彻底脱蜡。

【注】二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中操作。

(3) 室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次，每次5 min。

(4) 室温下，将切片样本按照顺序依次浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂

洗1次，每次5 min。

(5) 室温下，将切片浸没于纯水中漂洗1次，每次3 min，再将切片浸没于1×PBS 中漂洗1次，每次3 min，用滤纸

小心吸干切片样本周围多余液体。

(6) 用铅笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便后续进行通透与标记。

(7) 抗原修复：将改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)用微波炉加热至沸腾，将脱完蜡及复水好的片子置于缓冲液中，

间断煮沸10 min。抗原修复后取出于室温中缓慢降温。

【注】此过程中，玻片上组织要一直浸没于缓冲液中，以保证组织的抗原修复效果。不同的样本选择不同的抗原修

复方法。

(8) 1×PBS清洗两次。

3. 内源性过氧化物酶灭活（可选）

加入3%过氧化氢覆盖样品并在室温下孵育60 min，淬灭样品的内源性过氧化物酶活性。

4. 内源性生物素阻断（可选）

进行Biotin-tyramide/Streptavidin检测时，建议阻断样品中的内源性生物素以减少背景。对于Fluorescein/Cyanine 3/Cyanine 5 -Tyramide的试剂盒来说，可省略此步骤。

(1) 在室温下，将样品与未标记的链霉亲和素溶液一起孵育15 min。之后使用生物素封闭清洗缓冲液将样品在室温下洗涤3次，每次5 min。

(2) 在室温下将样品与生物素溶液孵育30 min，以封闭链霉亲和素上多余的生物素结合位点。之后用生物素封闭清洗缓冲液洗涤样品3次，每次5 min。

5. 免疫标记

(1) 封闭：用封闭缓冲液室温封闭1 h。

(2) 用封闭缓冲液将一抗稀释至适当的浓度。将样品与一抗在室温下孵育1 h或4℃过夜。

(3) 室温下1×PBS洗涤3次，每次5 min

(4) 在封闭缓冲液中将HRP偶连的二抗稀释。用该溶液在室温下孵育上述样品1 h。

(5) 室温下1×PBS洗涤3次，每次5 min。

(6) 每个样品准备100 μL-300 μL酪酰胺荧光工作液。染色液在室温下避光保存，最长可保存24 h。

(7) 将样品与染色液在室温下孵育10 min。

(8) 在室温下用1×PBS洗涤3次，每次5 min。

(9) 可选：如果使用Biotin-tyramide进行标记，可使用荧光标记的Streptavidin进行荧光显色

(10) 显微镜成像。对于载玻片上的组织样本，请盖上盖玻片并密封后，再显微镜成像。

1X Amplification Diluent和Blocking Reagent，2~8℃，避光保存，有效期6个月。

Fluorescein Tyramide，粉末状态，-25~-15℃保存，有效期6个月。溶于DMSO后，2~8℃，避光保存。