重组人泛素结合酶筛选试剂盒 E2选择泛素结合试剂盒（20440ES）
产品应用
泛素化是通过三个酶促步骤实现的。在ATP依赖的过程中，泛素激活酶(E1)催化与泛素形成活性硫酯键，然后转移到泛素载体蛋白的活性位点半胱氨酸(E2)。泛素级联对特定底物蛋白的选择性依赖于E2结合酶(细胞中包含的相对较少)和泛素-蛋白连接酶(E3)之间的相互作用，迄今为止已经鉴定出600多种这种酶。E3s是一个大的，多样化的蛋白质组，其特征是几个确定的基序之一。这些包括HECT(与e6相关蛋白c端同源)，RING(真正有趣的新基因)或U-box(没有Zn2+结合配体的完整补充的修饰的RING基序)结构域。而HECT E3s在泛素化过程中具有直接的催化作用，RING和U-box E3s促进蛋白质泛素化。 后两种E3类型充当适配器类分子。 它们使E2和底物足够接近，从而促进底物的泛素化。虽然许多RING-type e3，如MDM2和c-Cbl，可以单独发挥作用，但其他一些是作为更大的多蛋白复合体的组成部分，如后期促进复合体。综上所述，这些多面的特性和相互作用使E3s能够利用泛素-蛋白酶体系统，在真核生物的所有细胞中提供一种强大而具体的蛋白质清除机制。该筛选试剂盒集合了11种常用E2结合酶，可以筛选具有E3连接酶活性的蛋白所匹配的E2酶。
产品组分
| 组分编号 | 组分名称 | 规格 |
|---|---|---|
| 20440-A | 10× Reaction Buffer | 200 μL |
| 20440-B | 10× E1 Enzyme | 200 μL |
| 20440-C | 5× Ubiquitin（冻干粉中加400 μL水） | 400 μL |
| 20440-D | 10× Mg2+-ATP | 200 μL |
| 20440-E | 10× E3 Ligase Itch (Positive control) | 20 μL |
| 20440-F | 20× S5a substrate (Positivecontrol) | 20 μL |
| 20440-G | 20× UBE2R1/UbcH3/Cdc34 (2R1) | 15 μL |
| 20440-H | 20× UBE2N/UBE2V2 Complex (2N/2V2) | 15 μL |
| 20440-I | 20× UBE2D1/UbcH5a (D1） | 15 μL |
| 20440-J | 20× UBE2D2/UbcH5b (D2) | 15 μL |
| 20440-K | 20× UBE2D3/UbcH5c (D3) | 15 μL |
| 20440-L | 20× UBE2L3/UbcH7 (2L3) | 15 μL |
| 20440-M | 20× UBE2K/E2-25K (2K) | 15 μL |
| 20440-N | 20× UBE2C/UbcH10 (2C) | 15 μL |
| 20440-O | 20× UBE2H/UbcH2 (2H) | 15 μL |
| 20440-P | 20× UBE2L6/UbcH8 (2L6) | 15 μL |
| 20440-Q | 20× UBE2E1/UbcH6 (E1) | 15 μL |
阳性对照反应体系
| 组分 | 体积（μL） |
|---|---|
| ddH2O | to 20 μL |
| 10× Reaction Buffer | 2 μL |
| 10× E1 Enzyme | 2 μL |
| 5×Ubiquitin | 4 μL |
| 10× ATP-Mg | 2 μL |
| 20× E2 Enzyme | 1 μL |
| 10× E3 Ligase Itch (Positive control) | 2 μL |
| 20× S5a substrate (Positive control) | 1 μL |
*使用者自己准备，E3Ubiquitin Ligase 可重组表达或从细胞裂解液中纯化，Substrate(可选) not required for analyzing E3 Auto-Ubiquitination.
反应条件
37℃孵育（30min-2h，如果效果不明显可增加反应时间12h），建议使用PCR仪或金属浴。
结果检测
1.取样品20 μL加入5μL的5×SDS-PAGEBuffer（加入1μL新鲜配制的1MDTT），加热样品95℃ 5min，随后使用还原性（含DTT）上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳分析;
2.选择E3 Ubiquitin Ligase、泛素、Substrate 抗体进行 Western-blot 分析。
-80℃保存，1 年有效期。建议第一次使用时分装冻存，避免反复冻融。
