贻贝蛋白 Mussel Adhesive Protein_92369ES（92369ES）

贻贝蛋白（Mussel Adhesive Protein ,MAP)）是一种提取自海牡蛎（Mytilus edulis）由“多酚类蛋白质”组成的混合物。这一类相关的蛋白质是牡蛎在自然环境中分泌的，将其自身固定在坚固物体上的胶质的关键成分。这些蛋白质由重复排列的十肽单元组成，这些肽单元具有相似的氨基酸序列。贻贝蛋白可包被在培养器皿表面用于固定细胞或组织。贻贝蛋白能够轻易地附着于多种材料，例如玻璃、塑料甚至金属。它能够简化许多体外实验中的操作，包括：原代细胞培养的建立，原位杂交，免疫测定，显微注射，免疫组织化学染色。

该涂层透明且在2至8℃可保存10至14天。

包被方法

将贻贝蛋白包被表面主要有两种方法：手工涂布和吸附。

通常情况下，我们推荐使用吸附法，因为这种方法更为稳定且更方便，但手工涂布在某些特殊情况下也有其适用之处。

手工涂布法

贻贝蛋白可以通过机械分散的方式沉积在玻璃或塑料表面之上。使用一个便捷工具，例如玻璃棒或吸头尖端，可将1uL体积的贻贝蛋白溶液置于5%乙酸中，然后均匀铺展成一层薄薄的液体膜。随着乙酸挥发，贻贝蛋白膜便会残留下来。用乙醇和水清洗后，包被物即可使用。

虽然手工涂布的涂层不如吸附法那样均匀，但在某些特殊情况下（比如仅需对培养皿或载玻片的一部分进行涂布时）这种方法仍可适用。

吸附法

最简单且最高效的方法是贻贝蛋白是通过从中性溶液中吸附而制成的。该方法基于这样一个观察结果：当溶液的pH 值升高时，贻贝蛋白会从溶液中析出，并自发地吸附到它初次接触到的表面上。所得到的涂层非常薄（可能接近蛋白质单分子层），而且比手工涂布所获得的涂层更加均匀。

这种吸附方法的主要优点：

包被任何形状的涂层容器操作简单；

每平方厘米表面所需的贻贝蛋白包被材料更少；

具有更高的灵活性⃞初始浓度和吸附时间可以进行调整，以最适配特定的实验方案。

在使用吸附法时，应提前做好以下准备工作：

1.   当pH值开始调整时蛋白吸附过程会立即启动，因此在将贻贝蛋白溶液稀释至中性溶液后，应在10分钟内完成操作。

2.   由于贻贝蛋白在 2 - 8 ℃、5%醋酸环境中保存最稳定，因此只有在要使用时才需稀释原液。若用水将其稀释，应在当天使用；若将其稀释至中性溶液，则应立即使用。

3.   pH值是调节吸附作用的最重要的因素（最终的pH值应在 6.5 - 8.0 之间最为理想）。尽管大多数缓冲液都可以用来中和贻贝蛋白溶液，但碳酸氢钠的效果最佳。如果需要，可以按2：1体积加入贻贝蛋白溶液与 1N 氢氧化钠溶液，并与中性缓冲液一起混合，以使溶液达到中性pH值。

4.   操作过程中切勿使用受污染的移液吸头或其他工具。若溶液受到污染，贻贝蛋白将会沉淀在溶液瓶表面，从而导致产品损失。

吸附涂布基本操作流程

1.   准备一种中性缓冲液。在无菌涂布操作时，推荐使用0.1 M（pH8.0）的碳酸氢钠溶液,进行过滤除菌。

2.   计算所需贻贝蛋白的用量。根据要包被的器皿的规格和数量，计算总表面积。贻贝蛋白的最佳密度取决于您的具体应用或细胞类型。建议先进行初步的剂量反应实验以确定最佳密度。否则，初始密度可设为3.5 ug /cm2。高的密度的增加并不一定能提升效果，因此“最小有效密度”应通过实验来确定。

3.   中和贻贝蛋白溶液并进行包被。缓冲液的具体用量将取决于包被表面是否会被涂层覆盖。将适量的贻贝蛋白溶解在缓冲液中，充分混合，然后在  10  分钟内进行分配。

注意：若中和后缓冲液中的 pH 值不在 6.5 至 8.0之间，否则将无法达到最佳效果。要达到这个pH值范围，可以按2：1体积混合贻贝蛋白溶液体与1N氢氧化钠溶液，并与中性缓冲液一起混合。例如：使用 10uL贻贝蛋白、285uL碳酸氢钠（pH 值为 8.0）以及 5uL 1N 氢氧化钠（在包被前立即加入）来配制 300uL包被液。

4.   孵育。建议至少进行 20 分钟的孵育，但更长的时间也不会对吸附产生不利影响，即便所有液体都已蒸发。倒掉或吸干多余的液体，并用无菌水冲洗以去除碳酸氢盐。如果不是马上使用，应将其自然风干，在 2 ‒ 8℃保存至多两周，或者在干燥剂存在的情况下保存至多 4周。

特殊的包被方法

用于包被组织培养皿、培养瓶、玻璃载玻片和盖玻片的吸附法

需要考虑的事项：

1.   无菌涂布时，应在超净台内进行稀释和分配操作。对于吸附操作，可以将容器盖上并移至工作台面上。贻贝蛋白吸附在 37℃和室温下都能高效进行。

2.   通过减少体积来加快吸附过程。仅使用足够的缓冲液来覆盖容器底部。检查容器底部是否平整。

3.   先将缓冲液倒入培养瓶或培养皿中，然后直接加入贻贝蛋白溶液。务必充分混合这两种液体，并在重新吸取贻贝蛋白原液之前务必更换移液吸头。

4.   在进行试剂用量计算时，应依据有效培养面积而非培养皿直径来进行，以确保计算的准确性。一些常用的Falcon型号的培养耗材及其有效的培养面积如下：

A. 包被流程 ‒ 培养瓶、培养皿、盖片和载玻片

1.   计算需要包被的总面积以及所需的贻贝蛋白的用量。

2.   计算出覆盖培养器皿底部所需的缓冲液体积。

3.   对于细胞培养瓶，将无菌缓冲液分装到每个培养瓶中，并加入适量的贻贝蛋白，充分混合。切勿让贻贝蛋白原液与中和缓冲液的移液吸头尖端发生交叉污染，否则贻贝蛋白会吸附在原液瓶壁上。

4.   对于细胞培养皿：将缓冲液和贻贝蛋白放入试管中混合，然后将适量的混合液分装到每个培养皿中。

5.   对于载玻片或载片：这些载片或载玻片可以放置在培养皿底部，并用适量的中和后的贻贝蛋白溶液覆盖。它们也可以通过血涂片技术进行涂布。血涂片技术将在本节之后介绍。

6.   吸附过程至少需要 20 分钟。

7.   将贻贝蛋白溶液倒掉或吸出，并用无菌水冲洗两次。

8.   如果需要对包被后的器皿进行储存，应在 2 至 8 ℃的环境中自然风干后再进行储存。

血涂片技术（替代方法）

1.   这种方法是将20uL的中和后的贻贝蛋白均匀涂布在标准显微镜载玻片或盖玻片上。

2.   确定需要包被多少张载玻片或盖玻片；确保它们表面无灰尘和油脂。以20ug/张载玻片涂布密度开始，或者使用之前已确定的用量。

3.   将适量的贻贝蛋白原液转移至试管中，然后加入四分之一体积的2M碳酸钠溶液进行中和。由于所用体积较小，我们通过使用 2M 碳酸钠溶液替代0.1M 碳酸氢钠溶液来优化了这一技术。溶液混合时会起泡，所以一定要使用足够大的试管。向原溶液中加入 2-3%的异丙醇可降低表面张力，从而实现对载玻片或盖玻片的完全覆盖。

4.   可以将20uL已中和的贻贝蛋白溶液滴在载玻片的中央，该载玻片置于坚固的平面上。用第二块载玻片的短边以 45 度角倾斜的方式将液体均匀地涂抹在载玻片表面（这与制作血涂片所用的方法相同）。以类似的方式对剩余的载玻片进行涂覆。

5.   可以将一份中和后的贻贝蛋白溶液滴置于载玻片上，然后将第二片载玻片放置在该溶液滴上，让毛细作用使溶液在两片载玻片之间扩散。通过相互滑动来拉开载玻片。

6.   让载玻片或盖玻片自然风干。室温下，液体会在五分钟内完全蒸发掉。用蒸馏水冲洗载玻片或盖玻片。

7.   如果要立即使用包被器皿，可在用蒸馏水冲洗后加入细胞或组织切片。玻片在晾干后可存放在 2 至 8 ℃的环境中。

B. 多孔板包被操作流程

1.   计算需要包被的总表面积以及所需的贻贝蛋白的用量。

2.   计算出覆盖孔底所需的缓冲液体积。

3.   对于带有大孔径的培养板，先在试管中将缓冲液与贻贝蛋白混合，然后将其分装到各个孔中。

4.   对于小孔径培养皿（96  孔和  48 孔培养皿），将适量的贻贝蛋白与水混合，然后每孔加入10uL。并向每孔中加入至少 20 uL的碳酸氢盐缓冲液。

5.   至少需要孵育 20 分钟来进行吸附过程。

6.   轻轻倒掉或吸干贻贝蛋白溶液，然后用蒸馏水冲洗。

7.   如果培养板需要存放，先将其自然风干，然后在 2 至 8 ℃存放。

C. 可渗透支撑物（细胞培养插入件）的包被流程

1.   计算需要包被的总面积以及所需的贻贝蛋白的用量。由于插入件有多种规格可供选择，请正确计算表面积。

2.   计算出覆盖插入件底部所需的缓冲液体积。

3.   将缓冲液与贻贝蛋白加入试管中混合，然后将适量的混合液分别加入到各个培养器皿中。

4.   至少需要孵育 20 分钟来进行吸附过程。

5.   吸干多余的液体，并用ddH2O冲洗。

6.   如果需要将这些包被物进行储存，那么在 2 至 8℃的环境中进行自然风干后再进行保存。

细胞和组织的固定

接种细胞的操作流程

无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，在与贻贝蛋白包被的表面接触时都会发生黏附。实际上，这些细胞甚至无需保持活性状态。固定后的细胞也可以被吸附住，微生物（如酵母和细菌）也是如此。

偶尔出现的附着问题可归因于某些细胞（如脂肪细胞、 HL-60）以及微生物难以从悬浮液中沉淀下来。在这种情况下，应减少用于接种细胞的培养基总体积，直至其刚好覆盖容器底部。如果仍无法改善效果，可能就需要将细胞进行离心处理，使其附着在器皿表面。

细胞可以接种在含血清的培养基中，但在添加细胞之前不要在贻贝蛋白包被的器皿中预先加入该培养基。血清蛋白可能会封闭附着位点。为了提高细胞的附着速度，可以尝试在无血清培养基中接种细胞。细胞附着后再更换为含血清的培养基。

我们观察到，尽管悬浮细胞能迅速附着在贻贝蛋白包被的表面，但它们在数小时内就会开始脱落。这种脱落可能是由于细胞膜蛋白质的代谢更新所致，也可能是由于细胞的增殖。结果是悬浮细胞，比如杂交瘤细胞，在生长在贻贝蛋白包被的表面时不会形成独立的细胞克隆。

固定组织切片

使用常规方法将低温保存或石蜡组织切片固定在贻贝蛋白包被的载玻片上。在将切片固定好后，用纸巾吸去多余的水分，并将载玻片置于  45℃的温台上至少放置一小时。后续按照特定的实验要求对载玻片进行处理。

操作简单

每平方厘米表面所需的贻贝蛋白包被材料更少

注意事项:

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2. 本产品仅作科研用途！

存放在 2 - 8 ℃，包被物可在 2 - 8 ℃保存约两周。