SPiDER-βGal-1是一种适用于活细胞与活组织标记的荧光β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)底物。该底物SPiDER-βGal在β-半乳糖苷酶的酶促反应中迅速生成醌甲基化物，该产物是一种亲电子化合物，能够与邻近蛋白质中的亲核基团形成共价键，和带有-SH等亲核功能基团的蛋白质结合产生荧光。由于SPiDER-βGa具有理想的穿透细胞膜并停留在细胞内的能力，可以自我固定在细胞内的蛋白质上而停留在细胞内，从而实现荧光产物在活细胞内的固定，也可进行单细胞分析研究。

应用场景：

1. 适用于活细胞和固定细胞的染色；

2. 适用于组织切片的染色；

3. 适用于共聚焦显微镜或流式细胞仪检测系统；

1. 配置储存液

向每管（20 μg）产品中加入35.24 μL的DMSO，吹打至充分溶解，无明显不溶物，配置成1 mM的SPiDER-βGal-1储存液（母液）。

【注】储存液可保存于-20℃。

2. 配置工作液

用Hanks’HEPES缓冲液（Cat#60175ES，60176ES）稀释上述储存液，配置成1 μM的SPiDER-βGal工作液。

【注】为了维持细胞状态，推荐使用Hanks’HEPES缓冲液。

【注】如果想选用其他缓冲体系，也可以考虑PBS，HBSS等缓冲液。

【注】工作液不可久置，需现配现用，即刻使用。

3. 染色步骤

3.1 制备细胞悬液。

3.2 去除培养基，用Hanks’HEPES缓冲液洗涤细胞2次。

3.3 加入适量SPiDER-βGal工作液，37℃避光孵育15 min。

3.4 用缓冲液洗涤细胞，荧光显微镜或流式细胞仪观察细胞。

【注】染色后可不洗涤细胞，也能进行观察。

【注】孵育时间可根据实验具体情况进行适当调整。

【注】推荐波长：Ex：500～540 nm，Em：530～570 nm，若用共聚焦显微镜或流式细胞仪选择488 nm激发波长。

4. 荧光显微镜检测β-半乳糖苷酶表达的细胞（示例）

4.1 在含有DMEM培养基 (10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素) 的35 mm培养皿中接种500 μL的HEK细胞 (5×10⁵个/mL) 和500 μL的HEK/LacZ细胞 (5×10⁵个/mL)，在5% CO2、37℃培养箱中过夜培养。

4.2 加入2 mL的Hanks’HEPES缓冲液洗涤细胞2次。

4.3 向培养皿中加入2 mL的SPiDER-βGal工作液，37℃培养箱中孵育15 min。

4.4 去除上清液，加入2 mL的Hanks’HEPES缓冲液洗涤细胞2次。

4.5. 加入2 mL的Hanks’HEPES缓冲液，在荧光显微镜下观察细胞。

4.6. 去除上清液后，向培养皿中加入2 mL的4%多聚甲醛 (PFA) /PBS溶液，在室温下孵育15 min。

4.7 去除4%多聚甲醛/PBS溶液后，加入2 mL的Hanks’HEPES缓冲液洗涤细胞2次。

4.8 再加入2 mL的Hanks’HEPES缓冲液，在荧光显微镜下观察细胞。

4.9 滤光器 (波长/带通滤波器)，荧光成像：Ex：550/25 nm，Em：605/70 nm

【注】可以用4%多聚甲醛或甲醇固定细胞后，再进行荧光观察（也可观察到荧光），但固定细胞会降低β-半乳糖苷酶的活性，需根据实验实际情况摸索最佳实验条件。

【注】除了可以染色细胞，也可以染组织。染色组织的话，需要适当增加工作液浓度，如10-20 μmol/L。具体浓度可根据实验情况进行摸索调整。

5. 流式细胞仪检测β-半乳糖苷酶表达的细胞（示例）

5.1 在微型管中混合500 μL的HEK细胞 (5×10⁵个/mL) 和500 μL的HEK/LacZ细胞 (5×10⁵个/mL)。

5.2 向微型管中加入1 μL的SPiDER-βGal DMSO储存液，37℃下孵育15 min。

5.3 流式细胞仪分析细胞，激发波长：488 nm，530/30 nm带通滤波器。

2~8℃避光保存，有效期3年。