BS3 Crosslinker disodium（BS3交联剂二钠盐）是一种不可裂解的ADC连接子，可用于合成抗体偶联药物。ADC由抗体、细胞毒性药物和连接子三部分组成。BS3 Crosslinker disodium也是一种水溶性、同双功能且具有胺反应活性的交联剂，广泛用于将蛋白质共价固定于表面或微球上。

BS3是一种多功能且高效的交联剂，可用于将蛋白质共价固定于多种表面及微球上，是科研及药物开发领域众多应用的理想选择。

1. BS3 Crosslinker disodium水溶性较好，非常适合在水性缓冲液中进行反应，避免了使用可能损害蛋白质结构和功能的有机溶剂。

2. BS3可与存在于蛋白质N端及赖氨酸残基侧链上的伯胺（-氨基）反应，形成稳定的酰胺键。

3. BS3的一个关键特性是其膜不可渗透性，这使其成为在细胞表面交联蛋白质而不影响细胞内成分的理想选择。

4. BS3的两个N-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）酯可与蛋白质及氨基功能化表面或微球上的伯胺发生反应，该过程形成稳定的酰胺键，从而将蛋白质有效固定于载体上。

使用BS3进行蛋白质固定化的通用流程（供参考）：制备蛋白质及表面/微球、进行交联反应、淬灭未反应的BS3，并最终洗涤以去除副产物。

一. 实验方案：BS3将抗体固定于蛋白A/G微球上，进行免疫沉淀（仅供参考，具体请根据实际实验条件进行调整）

1. 实验材料：

1.1 蛋白A或蛋白G琼脂糖或磁性微球

1.2 目标抗体（置于无胺缓冲液如PBS中）

1.3 BS3交联剂

1.4 结合缓冲液：20 mM磷酸钠，0.15 M氯化钠，pH 7-9

1.5 淬灭缓冲液：1 M Tris-HCl（pH 7.5）或1 M甘氨酸

1.6 洗涤缓冲液（例如 PBST ：含0.05% Tween-20的PBS）

2. 操作步骤：

2.1 抗体结合：

2.1.1 用200 µL 偶联缓冲液两次洗涤50 µL 的Protein A/G磁珠。

2.1.2 将微球重悬于200 µL 结合缓冲液中。

2.1.3 向微球悬浮液中加入5-10 µg抗体。

2.1.4 在室温下轻柔旋转孵育1小时。

2.1.5 用200 µL 结合缓冲液洗涤抗体偶联微球两次，以去除未结合的抗体。

2.2 BS3交联：

2.2.1 使用前立即在结合缓冲液中配制5 mM BS3溶液。（注：BS3对湿度敏感，开启前需使小瓶平衡至室温）。

2.2.2 将抗体偶联微球重悬于250 µL 的5 mM BS3溶液中。

2.2.3 在室温下轻柔旋转孵育30分钟。

2.3 淬灭：

2.3.1 向磁珠悬浮液中加入12.5 µL 淬灭缓冲液（1 M Tris-HCl，pH 7.5）。

2.3.2 在室温下轻柔旋转孵育15分钟以终止反应。

2.4 清洗：

2.4.1 用200 µL 洗涤缓冲液将交联微球洗涤三次。

2.4.2 经共价固定抗体的微球已准备好，可用于免疫沉淀实验。

【注】也可使用BS3进行Pull-Down实验，通过BS3共价固定诱饵蛋白，防止实验过程中诱饵蛋白从磁珠上析出，从而降低背景干扰并提高结果的可靠性，制备磁珠的流程大致同上，将“抗体”替换为“诱饵蛋白”即可。

二. 实验方案：胺基功能化表面蛋白质固定通用方案（适用于ELISA 或生物传感器等）（仅供参考，具体请根据实际实验条件进行调整）

2.1 实验材料：

2.1.1 胺基功能化微孔板或传感器芯片

2.1.2 目标蛋白质（置于无胺缓冲液如PBS中，pH 7.4）

2.2 BS3交联：

2.2.1 反应缓冲液：100 mM磷酸钠，150 mM氯化钠，pH 7.2-8.0

2.2.2 淬灭缓冲液：1 M Tris-HCl，pH 7.5

2.2.3 洗涤缓冲液（例如： PBST）

2.2.4 阻断缓冲液（例如：含1% BSA的PBS溶液）

2.3 操作步骤：

2.3.1 表面处理：如有必要，可用反应缓冲液洗涤胺基功能化表面以达到平衡状态。

2.3.2 蛋白质与交联剂的制备：将蛋白质溶液按所需浓度（例如10–100 µg/mL）用反应缓冲液配制。

2.3.3 使用前立即在反应缓冲液中配制BS3溶液，使其终浓度为0.5-5 mM是合适的起始浓度范围。

2.4 交联反应：

主要有两种常用方法：

一步法：将蛋白质溶液与BS3溶液混合后立即加入胺功能化表面。

两步法（先进行表面活化）：首先，将胺基功能化的表面与BS3溶液共同孵育；洗涤掉多余的BS3后，再加入蛋白质溶液。此步骤有时可减少蛋白质间的交联反应。

对于一步法，将蛋白质/BS3混合物加入表面，并在室温下孵育30-60分钟。

2.5 淬灭与阻断：

2.5.1 吸出反应溶液，并用洗涤缓冲液冲洗表面一次。

2.5.2 加入淬灭缓冲液，并在室温下孵育15分钟以灭活残留的BS3。

2.5.3 用清洗缓冲液对表面进行三次洗涤。

2.5.4 加入封闭缓冲液，并在室温下孵育1小时，以封闭所有残留的非特异性结合位点。

2.6 洗涤：

2.6.1 用清洗缓冲液对表面进行3~5次洗涤。

2.6.2 固定化蛋白质的表面已准备好，可用于后续应用。

【注】交联反应的最佳范围：蛋白质：10-20 µM，BS3浓度（ 相对于蛋白质的摩尔过量值）：5-50倍，与伯胺发生NHS酯化反应的最佳pH范围：7.0-9.0，具体实验可根据实际情况调整实验的浓度、pH值和孵育时间等反应条件来进行摸索和操作）

注意事项：

1. 确保蛋白质溶液使用不含胺类的缓冲液（如PBS、 HEPES 或硼酸盐缓冲液），可提高固定效率。含Tris或甘氨酸的缓冲液会抑制BS3反应。

2. 注意反应缓冲液的pH值，pH值在7-9之间，可获得最佳反应活性，提高固定效率。

3. 提高BS3或蛋白的浓度，延长孵育时间，可提高固定效率。

4. 在固定化处理及与分析物孵育后，需进行充足的洗涤，可适当避免高背景值/非特异性结合。

5. 采用两步交联法可有效减少蛋白质聚集。

6. BS3交联的随机性，可能会改变酶活性位点或抗体结合位点中的赖氨酸残基，可能会导致蛋白活性丧失。可适当降低BS3的浓度，或缩短反应时间，或在固定化过程中应用底物或竞争性抑制剂保护活性位点，能够尽量避免该情况的发生。

-25~-15℃避光保存，有效期3年。