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无缝克隆引物设计原则？设计引物可否不引入酶切位点？退火温度如何选择（Tm 值如何算）？
无缝克隆引物设计原则？设计引物可否不引入酶切位点？退火温度如何选择（Tm 值如何算）？
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2026-08-24
a）设计原则：同源臂（15-25 bp，GC 含量 40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物（常规插入片段扩增引物）。
b）可以不引入。
c）计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的 Tm 值，引入的同源序列及酶切位点不应参与计算。
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