同源重组酶兼具外切酶活性、DNA 聚合酶活性及连接酶活性。
a）外切酶活性：该酶能特异性地识别载体和插入片段末端的 15-20bp 的同源序列， 并沿着 5'→3'方向切割dsDNA，从而产生粘性末端，粘性末端的碱基在 50℃作用下进行互补配对，将具备同源序列的载体与插入片段“融合”。
b）DNA 聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保证将片段和载体的 5’末端都降解成一样长的粘性末端，同源末端退火配对后，还存在单链的碱基缺口。故需要借助DNA 聚合酶活性进行修复。
c）连接酶活性：催化形成磷酸二酯键，将所有缺口缝合。