原因 1：载体线性化不完全
判断方法：将已制备的线性化的载体转化涂板，如果长克隆较多，则表示线性化不完全。解决方案：若线性化不完全则需优化酶切体系，例如提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等，具体优化操作可参考限制性内切酶供应商的使用说明（通常推荐双酶切）。
原因 2：反应体系中混入了相同抗性的环状质粒
产生原因：①以反向 PCR 方式进行载体线性化，残留环状质粒模板导致。
②目的基因PCR 模板为与载体相同抗性的环状质粒，残留环状质粒模板导致。
判断方法：将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板，如果长克隆较多，则表示有相同抗性的环状质粒混入。
解决方案：PCR 扩增产物先用DpnI 消化模板后，再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理，去除残留的环状模板质粒导致的假阳性。