一、背景介绍：从癌症液体活检到病原共感染检测的跨越

循环游离DNA（cfDNA）是指体液中游离于细胞外的片段化DNA分子，主要来源于细胞凋亡和坏死过程释放的基因组DNA片段，平均长度约为167 bp，呈现典型的核小体保护片段特征。在健康人群中，血浆cfDNA浓度仅约10~30 ng/mL，且主要以短片段形式存在。这一“微量但富含信息”的特征，既构成了cfDNA作为液体活检标志物的核心价值，也成为其检测技术开发的主要技术壁垒。

 

图1 液体活检技术全景图（图源网络 侵删）

 

过去十年间，cfDNA液体活检技术主要聚焦于肿瘤领域——通过检测循环肿瘤DNA（ctDNA）实现癌症的早期筛查、疗效监测和耐药突变追踪。然而，近年来的研究揭示了一个容易被忽视却至关重要的事实：血液中不仅存在宿主来源的cfDNA，还共存着微生物来源的游离DNA（microbial cell-free DNA，mcfDNA）。这些mcfDNA来自病原体在宿主内的复制和裂解过程，可被检测用于诊断血流感染、深部组织感染以及难以培养的病原体感染。

 

共感染——即患者同时感染两种或以上病原体——在临床中远比想象中常见。肿瘤患者因免疫功能低下常合并细菌或真菌感染，ICU患者易发生多病原体混合感染，而COVID-19患者合并细菌或曲霉菌感染更是显著增加死亡风险。然而，传统病原检测方法（如培养法、单一病原PCR）往往只能检测预设目标，极易漏检非目标病原体。mcfDNA宏基因组测序（mcfDNA metagenomic NGS）则提供了一种“一管血、一次测序”全覆盖的方案，有望彻底改变这一困境。

 

然而，mcfDNA的检测面临着两个核心挑战：其一，血液中mcfDNA的丰度极低，在健康人群中每毫升血浆仅含数pg到数十pg的微生物DNA；其二，宿主cfDNA占据了总cfDNA的绝大部分，微生物DNA信号被淹没在“宿主噪声”之中。研究指出，mcfDNA的检测受限于复杂的实验流程、高昂的测序成本和普遍的污染风险。要突破这些瓶颈，cfDNA的提取富集效率——尤其是对短片段、微量样本的回收能力——便成为整个技术链条中最为关键的一环。

二、技术应用：磁珠富集为何是病原共感染检测的“关键先生”

在多种cfDNA提取方法中，磁珠法凭借其独特的物理化学优势，已成为当前cfDNA提取应用最为广泛的主流技术。磁珠法的核心技术原理是固相可逆固定化（SPRI）——磁珠表面经功能化修饰后，在高浓度聚乙二醇（PEG）和盐离子存在下，能够选择性吸附DNA片段，再通过磁场分离和洗涤去除杂质，最后在低盐缓冲液中洗脱获得纯化的cfDNA。

 

对于病原共感染检测这一特殊应用场景，磁珠富集技术的价值尤其突出：

 

1、磁珠法对短片段cfDNA具有天然的亲和优势。 相较于传统的柱提法，磁珠法无需经过离心柱的物理筛分，因而对100~200 bp的短片段cfDNA的回收效率更高。主流cfDNA提取试剂盒针对血浆样本的cfDNA回收率可达90%以上。

 

2、磁珠法支持大体积起始样本处理，是“捞取”微量mcfDNA的前提。 由于血浆中mcfDNA含量极低，往往需要1~4 mL甚至更多血浆才能提取足够用于测序的DNA。磁珠法凭借其灵活的磁珠投料比例和规模化处理能力，能够适应从微量到高体积的全范围样本提取，而柱提法通常受限于离心柱的承载上限。

 

3、磁珠法可与自动化平台无缝衔接，满足病原检测对高通量的迫切需求。 在疫情暴发或大规模病原筛查场景下，手动提取既耗时又易出错。磁珠法与自动化提取仪的配合，可将96个样本的提取时间压缩至40分钟以内，极大提升了检测通量和批间一致性。

 

4、磁珠分选技术能够从总cfDNA中进一步“富集”目标片段，降低宿主背景噪声。 研究显示，在mcfDNA宏基因组测序中，宿主cfDNA占比过高是导致测序成本飙升的主要原因。而通过精确的磁珠分选策略（如双轮SPRI分选），可以将cfDNA片段范围锁定在100~200 bp区间，有效去除大片段宿主DNA污染，从而提升微生物reads的有效占比。

 

图2  cfDNA磁珠富集技术流程（图源网络 侵删）

 

三、常见实验方案：病原共感染cfDNA检测的全流程解析

一套完整的病原共感染cfDNA检测流程，可概括为以下五个关键环节：

1、样本采集与处理

采用EDTA抗凝管或专用cfDNA保存管采集全血，建议在采血后6小时内分离血浆，或使用cfDNA保存管将稳定期限延长至5~7天。

离心条件：推荐1,600 × g，10分钟，取上清后再以16,000 × g，10分钟进行二次离心以彻底去除残留细胞碎片。

血浆样本建议冻存于-80°C，避免反复冻融。

 

2、cfDNA提取——磁珠法的核心步骤

裂解结合：向血浆样本中加入裂解结合缓冲液和磁珠，充分混匀使cfDNA结合至磁珠表面。

磁分离与洗涤：将离心管置于磁力架上，待磁珠沉降后弃去上清，用洗涤缓冲液洗涤2~3次。

洗脱：加入洗脱缓冲液，室温孵育后磁分离收集上清，即得纯化的cfDNA。

关键质量控制点：全程使用无核酸酶耗材，操作区定期进行DNA去除处理，设置阴性对照以监控环境微生物DNA污染。

 

3、磁珠分选——进一步富集mcfDNA（可选，但强烈推荐）

针对宿主背景过高的问题，可对提取的cfDNA进行片段长度分选。典型方案采用双轮磁珠分选：

第一轮：0.47×磁珠体积比，结合并去除大片段DNA（>400 bp）

第二轮：0.33×磁珠体积比，回收100~200 bp片段，弃去更小片段

（备注：具体分选比例参考对应产品说明书）

该策略可将宿主cfDNA占比显著降低，同时保留微生物来源的cfDNA，有研究显示此类富集策略可使mcfDNA reads占比提升60~164倍。

 

4、文库构建与测序

推荐使用低起始量的DNA文库构建试剂盒（如基于酶切法的建库方案），尽可能减少连接反应中的样本损失。

可采用PCR-free建库方案以保留原始甲基化修饰信息，但需确保输入DNA量充足。

测序平台选择：Illumina平台推荐双端150 bp测序模式，最低测序深度建议30~50 M reads/样本，以保证低丰度微生物的有效检出。

 

5、数据分析与病原鉴定

测序数据首先过滤去除低质量序列和人源宿主reads。

剩余reads与微生物参考基因组数据库进行比对，常用数据库包括NCBI RefSeq、GTDB、MGE等。

设定检出阈值：通常要求物种特异性reads数≥2（严格）或≥5（保守），且覆盖度≥0.5×。

 

四、总结

cfDNA磁珠富集技术正站在液体活检从“单一肿瘤检测”走向“宿主-微生物全景分析”的十字路口。在病原共感染检测这一极具临床紧迫性的领域，磁珠法凭借其对短片段核酸的高效回收、大体积样本的处理能力、自动化适配的便捷性以及片段选择性富集的灵活性，已成为推动mcfDNA宏基因组测序走向临床的核心技术引擎。

 

当前的研究共识已明确：同时分析宿主cfDNA与微生物mcfDNA，能够为疾病诊断提供互补的双重视角，尤其在感染性疾病与肿瘤共存的复杂临床情境中具有不可替代的价值。翌圣生物深耕磁珠法核酸提取与NGS建库领域多年，提供从cfDNA提取、片段分选到文库构建的全流程产品矩阵，致力于以高性能、高稳定性的国产试剂，助力科研人员和临床检验工作者突破mcfDNA检测的技术瓶颈，让“一管血查清全部病原”从愿景走向现实。

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