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Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® 一步法DNA建库试剂盒
产品货号:12203ES08
产品规格:8 libraries
产品价格:¥3656.00
类别:DNA-Seq

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  • 产品信息


    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®

    “一步法”DNA建库试剂盒

    12203ES08

    8 T

    3683.00

    12203ES24

    24 T

    7583.00

    12203ES96

    96 T

    28663.00


    产品描述


    Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较,本品采用高质量的片段化酶,摆脱了繁琐的超声过程,同时简化了操作流程,将片段化模块与末端修复模块合二为一,极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率,可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本,同时能兼容FFPE DNA样本的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖度高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单高效。

    适用500 pg-1 μg的基因组DNA、全长cDNA等样本

    高质量片段化酶,可随机切割双链DNA,酶切片段无偏好性

    片段化、末端修复/A一步完成

    强扩增效率的高保真酶,显著提高文库质量及产量

    适用于FFPE DNA样本

    严格的批次性能与稳定性质控


    产品组分


    组分编号与名称

    12203ES08

    12203ES24

    12203ES96

    12203-A

    图片1.png


    Smearase® Mix

    80 μL

    240 μL

    960 μL

    12203-B

    图片2.png


    Ligation Enhancer

    240 μL

    720 μL

    4×720 μL

    12203-C

    图片2.png


    Quick T4 DNA Ligase

    40 μL

    120 μL

    480 μL

    12203-D

    图片3.png


    2×Super Canace®Ⅱ High-Fidelity Mix

    200 μL

    600 μL

    4×600 μL

    12203-E

    图片3.png


    Primer Mix

    40 μL

    120 μL

    480 μL


    运输与保存方法


    冰袋运输。所有组分-20°C保存,有效期1年。


    注意事项


    一、关于操作


    1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

    3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

    4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

    5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

    6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用专用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。


    二、关于DNA片段化


    1. 本试剂盒兼容范围为500 pg – 1 μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA。

    2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将DNA稀释在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中进行片段化。

    3. 对于常规的高质量基因组DNA,酶切时间参考表5,本试剂盒片段化偏好低,耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本,酶切时间参考表6。以上为推荐时间,需客户在自己的实验体系中进行微调,以达到最佳效果。

    4.为保证优质精确的片段化效果,片段化反应配制过程请于冰上操作。

    5. 针对FFPE DNA建库,若样本质量不佳,客户对当前建库产量不满意,可选购我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)对FFPE DNA进行修复,具体使用方法可参考此产品说明书。该试剂可与片段化末修加A过程同时进行,无需额外的操作。


    三、关于接头连接(Adapter Ligation)


    1. 针对Illumina®测序平台,Yeasen提供48种Barcoded Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4(Cat#12615~Cat#12618);单端 96种 Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612);双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12613~Cat#12614)。

    2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer;用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒,不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。


    表1  500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

    Input DNA

    Adapter : Input DNA摩尔比

    Input DNA

    Adapter : Input DNA摩尔比

    1 μg

    10:1

    50 ng

    100:1

    500 ng

    20:1

    25 ng

    200:1

    250 ng

    40:1

    1 ng

    200:1

    100 ng

    100:1

    500 pg

    400:1

    【注】:Input DNA摩尔数(pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp)]。


    四、关于磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)


    1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前,或接头连接后,或文库扩增后进行。

    2. 当Input DNA质量≥50 ng,您可选择在接头连接后分选;如Input DNA质量<50 ng,建议您在文库扩增后进行分选。

    3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG,会对双轮分选产生显著影响。因此,如在接头连接后进行长度分选,必须先进行纯化步骤,再进行双轮分选步骤;如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选,可直接进行双轮磁珠分选步骤。

    4. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

    5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

    6. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

    7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

    8. 进行长度分选时,初始样品体积应尽量≥100 μL,不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。

    9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

    10. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于4°C可保存1-2周,-20°C可保存1个月。


    五、关于文库扩增(Library Amplification)


    文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒,获得1 μg文库的推荐循环数。


    表2  500 pg-1 μg Input DNA获得1 μg产物扩增循环数推荐表

    Input DNA(ng)

    Number of cycles required to generate

    1 μg

    1 μg

    3 - 5**

    500 ng

    4 - 6

    200 ng

    5 - 7

    50 ng

    7 - 9

    1 ng

    13 - 15

    500 pg

    14 - 16

    【注】:**如果使用了不完整的接头,需要扩增1-3个循环,形成完整的接头。建库过程中若进行片段分选,扩增时请参照较高循环数扩增。

    六、关于文库质检(Library Quality Analysis)


    1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

    2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。

    3. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

    4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。

    5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。


    使用方法


    一、自备材料


    1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。

    2. DNA质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

    3. DNA Adapter:Yeasen提供48种Barcoded Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4(Cat#12615~Cat#12618);单端 96种 Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612);双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12613~Cat#12614)。或其他等效产品。

    4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。


    二、操作流程


    image.png 

    图1 OnePot DNA建库试剂盒操作流程


    三、操作步骤


    3.1 DNA片段化/末端修复/dA尾添加(DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing)


    该步骤将基因组DNA片段化,同时进行末端修复及dA尾添加。

    1. 将表3中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于冰上配制表3反应体系。


    表3  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

    名称

    体积(μL)

    Input DNA

    x

    Smearase® Mix

    10

    ddH2O

    Up to 60 μL

    3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

    4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表4所示反应程序,进行DNA片段化,末端修复及dA尾添加反应。

    表4  DNA片段化/末端修复/dA尾添加PCR反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    On

    4 °C

    1 min*

    30 °C

    3-20 min**

    72 °C

    20 min

    4 °C

    Hold

    【注】:*DNA片段化过程为有效控制片段化效果,避免过度酶切,反应程序可预先设置4°C,待模块温度降至4°C时,将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA,酶切时间参考表5;对于质量不一的FFPE DNA样本,酶切时间参考表6。


    表5  常规基因组DNA片段化时间选择表 表6  FFPE DNA片段化时间选择表

    插入片段主峰大小

    片段化时间

    优化范围

    600 bp

    5 min

    3-8 min

    350 bp

    8 min

    5-12 min

    250 bp

    10 min

    8-15 min

    200 bp

    13 min

    10-20 min

    150 bp

    20 min

    12-25 min


    插入片段主峰大小

    片段化时间

    DIN*

    250 bp

    9-13 min

    > 8.0

    250 bp

    8-11 min

    6.5-8.0

    250 bp

    4-8 min

    4.2-6.5

    250 bp

    3-6 min

    2.5-4.2

    【注】:*DIN为DNA Integrity Number,是用Agilent 2200来定义FFPE DNA降解程度的一种方法,详见图2。

    图片2.2.png 

    图2  Agilent 2200定义不同降解程度样本的DIN值


    3.2 接头连接(Adapter Ligation)


    该步骤将3.1步骤的产物末端,连接特定的Illumina®接头。

    1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。

    2. 将表7中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    3. 于3.1步骤PCR管中配制表7所示反应体系。

    表7  Adapter Ligation PCR体系

    名称

    体积(μL)

    dA-tailed DNA(3.1步骤产物)

    60

    Ligation Enhancer

    30*

    Quick T4 DNA Ligase

    5

    DNA Adapter

    5**

    【注】:*Ligation Enhancer比较粘稠,请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

    **本公司接头浓度与常规商业化试剂盒一致,皆为15 μM。

    【接头添加计算举例当Input DNA100 ng,Input DNA长度为300 bp时,接头应该添加多少?

    第一步:计算Input DNA摩尔数。公式:Input DNA摩尔数(pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp)];Input DNA摩尔数(pmol=100÷0.66×300=0.5 pmol

    第二步:计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表1查询接头添加比例;

    根据表1,查得Input DNA 100 ng时接头添加比例100:1接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol

    第三步:计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L(如使用其他接头,浓度需要依据其他接头浓度参数);

    接头添加体积=接头添加摩尔数(50 pmol÷接头浓度(15 μmol/L=3.34 μL(注:15 μmol/L=15 pmol/μL

    综上,接头可添加3.4 μL,加1.6 μL水补齐至5 μL。(注:接头最大加入体积不超过5 μL)。

    4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表8所示反应程序,进行接头连接反应。


    表8  Adapter Ligation PCR反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    Off

    20°C

    15 min

    4°C

    Hold

    【注】:当Input DNA量较低,实验效果不理想时,可尝试将连接时间延长一倍。


    3.3 连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)


    该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。


    3.3.1 纯化操作步骤:


    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

    2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

    3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min。

    4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

    6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

    7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

    8. 将PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:

    1)如产物无需进行片段分选,直接加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。

    2)如产物需进行双轮分选,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。


    3.3.2 双轮分选操作步骤:


    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡约30 min。配制80%乙醇。

    2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

    3. 根据DNA片段长度要求,参考表9向上述100 μL DNA上清中加入第一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。


    表9磁珠文库分选推荐比例

    DNA文库插入片段大小

    150-250 bp

    200-300 bp

    300-400 bp

    400-500 bp

    500-600 bp

    DNA文库大小

    250-350 bp

    350-450 bp

    450-550 bp

    550-650 bp

    650-750 bp

    第一轮体积比(Beads:DNA)

    0.80×

    0.70×

    0.60×

    0.55×

    0.50×

    第二轮体积比(Beads:DNA)

    0.20×

    0.20×

    0.20×

    0.15×

    0.15×

    【注】:表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为250 bp,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.70×100 μL=70 μL;第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL;表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA(Post Ligation),如果用户在接头连接前进行分选,请采用Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)说明书中推荐的比例。

    4. 室温孵育5 min。

    5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。

    6. 参考表7向上清中加入第二轮分选磁珠。

    7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。

    8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    9. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

    10. 重复步骤9。

    11. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

    12. 将PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

    13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中。


    3.4 文库扩增(Library Amplification)


    该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

    1. 将表10中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。


    表10  PCR扩增反应体系

    名称

    体积(μL)

    2×Super Canace®Ⅱ High-Fidelity Mix

    25

    Primer Mix

    5

    Adapter Ligated DNA(3.3步骤产物)

    20

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表11所示反应程序,进行PCR扩增。


    表11  PCR扩增反应程序

    温度

    时间

    循环数

    98°C

    1 min

    1

    98°C

    10 sec

    参照注意事项中表2

    60°C

    30 sec

    72°C

    30 sec

    72°C

    5 min

    1

    4°C

    Hold

    -


    3.5 扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection)


    同3.3.1步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。

    如需分选,操作方法同3.3.2双轮分选步骤。


    3.6文库质量控制


    通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。


    3.7参考实例


    使用Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®对小牛胸腺gDNA样本进行酶切建库检测,片段化结果见图3,建库结果见图3。

     image.png

    图3  OnePot DNA建库试剂盒酶切800 ng小牛胸腺gDNA样本(不同酶切时间片段化效果检测)

    1567389676115555.png 

    图4  使用本试剂盒进行human gDNA样本建库,文库进行电泳检测

    (Input DNA为500 ng,酶切20 min,扩增5 cycles) 


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    产品编号

    规格

    Hieff NGS® cfDNA Clean Beads(100~200 bp)

    12599ES08/56

    5/60 mL

    Hieff NGS® Smarter DNA Clean beads (50 bp以上)

    12600ES08/56

    5/60 mL

    Hieff NGS® DNA Selection Beads(Superior AMPure XP alternative)

    12601ES08/56

    5/60 mL

    Hieff NGS® RNA Cleaner

    12602ES08/56

    5/60 mL

    Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit

    12603ES24/96

    24/96 T

    建库接头

    产品编号

    规格

    Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 1/2

    12611/12612ES02

    48×2 T

    Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina®, Set 1/2

    12613/12614ES02

    96×2 T

    Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1/2

    12615/12616ES04/16

    12×4/12×16 T

    Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3/4

    12617/12618ES04/16

    12×4/12×16 T

    Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®,(96 Index)

    12610ES96

    96 T

    建库模块

    产品编号

    规格

    Hieff NGS® Fast-Pace DNA Fragmentation Reagent

    12609ES24/96

    24/96 T

    Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module

    12608ES24/96

    24/96 T

    2×Ultima Amplification Mix

    12620ES24/96

    24/96 T

    2×Super Canace® High-Fidelity Mix

    12621ES03/08

    24/96 T

    Hieff NGS® Dual-Mode cDNA Synthesis Kit

    12250ES24/96

    24/96 T

    文库定量

    产品编号

    规格

    Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix

    12302ES05

    500 T

    Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard (1-6)

    12307ES09

    6×96 μL

    dsDNA HS Assay Kit for Qubit® 

    12640ES60/76

    100/500 T

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    HB190830