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Hieff  NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI
产品货号:13321ES16
产品规格:16 T
产品价格:¥5363
类别:DNA-Seq

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  • 产品信息


    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for MGI®

    13321ES16

    16 T

    5363

    13321ES96

    96 T

    26563


    产品描述


    Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for MGI®是针对MGI®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较,本品采用高质量的片段化酶,摆脱了繁琐的超声过程,同时简化了操作流程,将片段化模块与末端修复模块合二为一,极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率,可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本,同时能兼容FFPE DNA样本的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖度高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单高效。

    Ø 适用10 ng-1 μg的基因组DNA、全长cDNA等样本

    Ø 高质量片段化酶,可随机切割双链DNA,酶切片段无偏好性

    Ø 片段化、末端修复/加A一步完成

    Ø 强扩增效率的高保真酶,显著提高文库质量及产量

    Ø 适用于FFPE DNA样本

    Ø 严格的批次性能与稳定性质控


    产品组分


    组分编号与名称

    13321ES16

    13321ES96

    13321-A

    图片5.png

    Smearase® Mix

    160 μL

    960μL

    13321-B

    图片6.png

    Ligation Enhancer

    480 μL

    4×720μL

    13321-C

    图片6.png

    Fast T4 DNA Ligase

    80 μL

    480μL

    13321-D

    图片7.png

    2×Ultima HF Amplification Mix

    400 μL

    4×600μL

    13321-E

    图片7.png

    Primer Mix for MGI®

    80 μL

    480μL


    运输与保存方法


    冰袋运输。所有组分-20°C保存,有效期1年。


    注意事项


    一、关于操作


    1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

    3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

    4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

    5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

    6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用专用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。


    二、关于DNA片段化


    1. 本试剂盒兼容范围为10 ng – 1 μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高质量Input DNA。

    2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将DNA稀释在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中进行片段化。

    3. 对于常规的高质量基因组DNA,酶切时间参考表5,本试剂盒片段化偏好低,耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本,酶切时间参考表6。以上为推荐时间,需客户在自己的实验体系中进行微调,以达到最佳效果。

    4.为保证优质精确的片段化效果,片段化反应配制过程请于冰上操作。

    5. 针对FFPE DNA建库,若样本质量不佳,客户对当前建库产量不满意,可选购我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)对FFPE DNA进行修复,具体使用方法可参考此产品说明书。该试剂可与片段化末修加A过程同时进行,无需额外的操作。


    三、关于接头连接(Adapter Ligation)


    1. 目前华大智造有2种序号的接头:1-128和501-596。关于其使用要求,请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨询本公司。此外,华大智造申明:2种接头由于设计工艺不同,禁止混用,否则测序数据无法拆分!

    2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。请按照表1和实际DNA投入量确实确定接头用量,需要稀释接头时,请用TE buffer对接头进行稀释。

    表1 10ng-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

    Input DNA

    10μM Adapter稀释倍数

    稀释后投入量(μL)

    31ng-1 μg

    不稀释

    5

    10-30 ng

    5

    5


    四、关于磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)


    1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前,或接头连接后,或文库扩增后进行。

    2. 当Input DNA质量≥50 ng,您可选择在接头连接后分选;如Input DNA质量<50 ng,建议您在文库扩增后进行分选。

    3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG,会对双轮分选产生显著影响。因此,如在接头连接后进行长度分选,必须先进行纯化步骤,再进行双轮分选步骤;如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选,可直接进行双轮磁珠分选步骤。

    4. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

    5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

    6. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

    7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

    8. 进行长度分选时,初始样品体积应尽量≥100 μL,不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。

    9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

    10. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于4°C可保存1-2周,-20°C可保存1个月。


    五、关于文库扩增(Library Amplification)


    文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒,获得1 μg文库的推荐循环数。

    表2  10 ng-1 μg Input DNA获得1 μg产物扩增循环数推荐表

    Input DNA(ng)

    Number of cycles required to generate

    1 μg

    1 μg

    3 - 5

    500 ng

    4 - 6

    200 ng

    5 - 7

    50 ng

    8 - 10

    10 ng

    10 - 12

    【注】:建库过程中若进行片段分选,扩增时请参照较高循环数扩增。


    六、关于文库质检(Library Quality Analysis)


    1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

    2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。

    3. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

    4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。

    5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。


    使用方法


    一、自备材料

    1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。

    2. DNA质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

    3. DNA Adapter:详情请咨询华大智造或本公司。

    4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。


    二、操作流程

    图片1.png

    图1 OnePotTM II DNA建库试剂盒操作流程 


    三、操作步骤

    3.1DNA片段化/末端修复/dA尾添加(DNAFragment/End Preparation/dA-Tailing)

    该步骤将基因组DNA片段化,同时进行末端修复及dA尾添加。

    1. 将表3中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于冰上配制表3反应体系。

     表3  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

    名称

    体积(μL)

    Input DNA

    x

    Smearase® Mix

    10

    ddH2O

    Up to 60 μL

    3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

    4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表4所示反应程序,进行DNA片段化,末端修复及dA尾添加反应。

    表4  DNA片段化/末端修复/dA尾添加PCR反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    On

    4 °C

    1 min*

    30 °C

    3-20 min**

    72 °C

    20 min

    4 °C

    Hold

    【注】:*DNA片段化过程为有效控制片段化效果,避免过度酶切,反应程序可预先设置4°C,待模块温度降至4°C时,将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA,酶切时间参考表5;对于质量不一的FFPE DNA样本,酶切时间参考表6。

    1.jpg

    图片2.png 

    图2  Agilent 2200定义不同降解程度样本的DIN值


    3.2 接头连接(Adapter Ligation)

    该步骤将3.1步骤的产物末端,连接特定的MGI®接头。

    1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。

    2. 将表7中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    3. 于3.1步骤PCR管中配制表7所示反应体系。 

    名称

    体积(μL)

    dA-tailed DNA(3.1步骤产物)

    60

    Ligation Enhancer

    30*

    Fast T4 DNA Ligase

    5

    DNA Adapter

    5

    表7  Adapter Ligation PCR体系

    【注】:*Ligation Enhancer比较粘稠,请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

    4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表8所示反应程序,进行接头连接反应。

    表8  Adapter Ligation PCR反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    Off

    20°C

    15 min

    4°C

    Hold

    【注】:当Input DNA量较低,实验效果不理想时,可尝试将连接时间延长一倍。

    3.3 连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)

    该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。

    3.3.1 纯化操作步骤:

    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

    2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

    3. 吸取80μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min。

    4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

    6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

    7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

    8. 将PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:

    1)如产物无需进行片段分选,直接加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠

    2)如产物需进行双轮分选,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。

    3.3.2 双轮分选操作步骤:

    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡约30 min。配制80%乙醇。

    2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

    3. 根据DNA片段长度要求,参考表9向上述100 μL DNA上清中加入第一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。

    表9磁珠文库分选推荐比例

    DNA文库插入片段大小

    150-250 bp

    200-300 bp

    300-400 bp

    DNA文库大小

    230 - 330 bp

    280-380 bp

    380-480 bp

    第一轮体积比(Beads:DNA)

    0.80×

    0.75×

    0.65×

    第二轮体积比(Beads:DNA)

    0.20×

    0.20×

    0.20×

    【注】:表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为250 bp,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.70×100 μL=70 μL;第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL;表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA(Post Ligation),如果用户在接头连接前进行分选,请采用Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)说明书中推荐的比例。

    4. 室温孵育5 min。

    5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。

    6. 参考表7向上清中加入第二轮分选磁珠。

    7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。

    8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    9. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

    10. 重复步骤9。

    11. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

    12. 将PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

    13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中。

    3.4 文库扩增(Library Amplification)

    该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

    1. 将表10中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    2.于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。

    表10  PCR扩增反应体系

    名称

    体积(μL)

    2×Ultima HF Amplification Mix

    25

    Primer Mix for MGI

    5

    Adapter Ligated DNA(3.3步骤产物)

    20

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表11所示反应程序,进行PCR扩增。

    表11  PCR扩增反应程序

    温度

    时间

    循环数

    98°C

    1 min

    1

    98°C

    10 sec

    参照注意事项中表1

    60°C

    30 sec

    72°C

    30 sec

    72°C

    5 min

    1

    4°C

    Hold

    -

    3.5 扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection)

    同3.3.1步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。

    如需分选,操作方法同3.3.2双轮分选步骤。

    3.6文库质量控制

    通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。

    3.7 文库环化

    使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI®(Cat#13341)或其他等效产品进行文库单链环化反应。

    3.8 参考实例

    使用Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for MGI®对小牛胸腺gDNA样本进行酶切建库检测,片段化结果见图3;建库结果见图4。

    图片3.png 


    图3  OnePotTM II DNA建库试剂盒酶切800 ng小牛胸腺gDNA样本(不同酶切时间片段化效果检测)

    图片4.png

    图4  使用本试剂盒进行human gDNA样本建库,文库进行电泳检测

    (Input DNA为50 ng,酶切12 min,扩增8 cycles)


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    Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix

    12302ES05

    500 T

    1526

    Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard (1-6)

    12307ES09

    6×96 μL

    2126

    dsDNA HS Assay Kit for Qubit® 

    12640ES60/76

    100/500 T

    686/2696

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    HB191112