背景介绍

线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP），又称线粒体巨型通道（magachannel），是存在于线粒体内外膜之间的非选择性高导电性通道，由多种蛋白质复合组成。

正常的细胞线粒体内膜可维持正常的线粒体电位梯度以保证细胞呼吸作用及能量供应，随着Ca2+的摄入和释放，一种低电导渗透性转换孔在张开和闭合中来回切换。当细胞发生凋亡时和病理性死亡时，线粒体膜电位转换孔渗透性发生改变，Ca2+的过载，线粒体谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后继细胞色素C的释放，线粒体膜电位下降等都会导致线粒体渗透性转换孔的激活。通常线粒体Ca2+超载、线粒体谷胱甘肽氧化、线粒体活性氧水平升高和其他促凋亡都会导致线粒体通透性转换孔（mPTP）的不可逆性开放，这会改变线粒体的渗透性，导致线粒体损伤以及跨膜电位降低以致消失。

产品简介

粒体膜通透性转换孔检测试原理是：首先通过被动运输加载Calcein AM，Calcein AM能够轻易穿透活细胞膜，被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子 Calcein从而被滞留在细胞内，使胞质包括线粒体发出强绿色荧光。加入CoCl2后，由于金属离子Co2+和calcein的络合，来自胞质的荧光被CoCl2淬灭，仅留下线粒体内的荧光。

作为对照，可将细胞加载Calcein AM和CoCl2的同时，对其用离子霉素处理，离子霉素作为钙离子载体，使得线粒体Ca2+浓度增加，导致线粒体Ca2+超载从而触发mPTP的开关，mPTP被激活后导致线粒体荧光淬灭。

检测操作

实验试剂

1、Calcein AM （Ex/Em: 494/517 nm）（Cat#40719ES）

2、CoCl2

3、Ionomycin（Cat#50401ES）

4、MitoTracker red CMXRos（Ex/Em: 579/599 nm）（Cat#40741ES）

【MitoTracker非必须；荧光检测时推荐使用】

5、Hoechst 33342（350/461 nm）【非必须】（Cat#40731ES）

6、DMSO（Cat#60313ES）

7、PBS（Cat#41403ES）

注：PBS或无血清培养基均可。

分组设置

荧光检测

对照组1：细胞+Calcein AM +MitoTracker red CMXRos+Hoechst 33342；

对照组2：细胞+Calcein AM +MitoTracker red CMXRos+Hoechst 33342+CoCl2;

离子霉素对照组：细胞+Calcein AM +MitoTracker red CMXRos+Hoechst 33342+CoCl2+Ionomycin；

流式检测

空白对照：仅细胞

对照组1：细胞+Calcein AM ；

对照组2：细胞+Calcein AM +CoCl2;

离子霉素对照组：细胞+Calcein AM +CoCl2+Ionomycin；

 

荧光染色操作步骤

1、储存液及工作液的配置

Calcein AM ：DMSO配置储存液浓度为1mM。

CoCl2：储存液1 M。

Ionomycin：储存液 1 mM。

Hoechst 33342：储存液1mM。

MitoTracker red CMXRos储存液1 mM。

2、染色步骤

于培养皿/板内/共聚焦小皿中加入适量的培养基进行细胞培养及对应处理。

配置染色工作液，按照分组分别配置不同的染色液，具体为：1ml的体系中加入如下试剂及染料

 

	Calcein AM	CoCl2	Ionomycin	Hoechst 33342	MitoTracker red CMXRos
对照组1	1 μL	无	无	1 μL	1 μL
对照组2	1 μL	1 μL	无	1 μL	1 μL
离子霉素对照	1 μL	1 μL	1-2  μL	1 μL	1 μL

然后加入996 μL PBS（无血清培养基），混匀后于37℃预热。

弃掉培养基后，PBS清洗2次，加入预热的染色工作液避光孵育15-30min。

注：离子霉素对照在染色完成清洗后加入，离子霉素Ionomycin工作浓度0.5~1.0 μM（1mL染色液中加入1-2 μL Ionomycin储存液）。

PBS清洗2次后，加入预热的PBS或培养基使用荧光显微镜、共聚焦显微镜进行检测，通道选择calcein为绿色，Hoechst 33342为蓝色，MitoTracker为红色。

注意：Hoechst 33342及MitoTracker red CMXRos均为非必须。

  

流式检测操作步骤

1、储存液及工作液的配置

Calcein AM ：DMSO配置储存液浓度为1mM，使用时配置为2 μM工作液。

CoCl2：储存液80 mM。

Ionomycin：储存液100 μM。

2、染色步骤

离心收集细胞，吸去上清，加入预热的PBS重悬细胞，使密度为10^6/mL。

按照下表在1ml的细胞悬液中添加如下试剂，37℃避光孵育15min。

	Calcein AM	CoCl2	Ionomycin
空白对照	无	无	无
对照组1	5 μL	无	无
对照组2	5 μL	5 μL	无
离子霉素对照	5 μL	5 μL	5 μL

染色结束后，PBS清洗后重新加入400 μL PBS缓冲液，使用流式细胞仪进行检测，通道选择FITC。

荧光检测结果展示：

 

 

上图仅孵育细胞（卵泡颗粒细胞fGCs）与钙黄绿素（Calcein）时显示出强烈的绿色荧光。进一步与CoCl2孵育（Calcein + CoCl2）细胞质中钙黄绿素的绿色荧光被淬灭，只有线粒体显示绿色荧光，因为加入CoCl2后，由于金属离子Co2+和calcein的络合，来自胞质的荧光被CoCl2淬灭，仅留下线粒体内的荧光。以离子霉素作为阴性对照（Calcein+ CoCl2+lonomycin），荧光信号被全部淬灭，因为离子霉素作为钙离子载体，使得线粒体Ca2+浓度增加，导致线粒体Ca2+超载从而触发mPTP的开关，mPTP被激活后导致线粒体荧光也被淬灭。

流式检测结果展示：

图A在仅Calcein-AM无CoCl2和离子霉素的情况下，细胞质和线粒体中存在荧光钙黄绿素，产生明亮的信号。图B在存在CoCl2的情况下，仅线粒体中的钙黄绿素发出荧光信号，但胞质钙黄绿素荧光淬灭，与图A相比，总荧光降低。图C当离子霉素、CoCl2与钙黄绿素AM同时加入细胞时，来自细胞质和线粒体的荧光信号会大大下降。

参考文献

1. Zhao S,Gong J,Wang Y, et al. Sirtuin 3 regulation: a target to alleviate β-hydroxybutyric acid-induced mitochondrial dysfunction in bovine granulosa cells. J Anim Sci Biotechnol. 2023;14 (1):18. doi:10.1186/s40104-022-00825-w

2. Bravo A,Sánchez R,Zambrano F, et al. Exogenous Oxidative Stress in Human Spermatozoa Induces Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore: Effect on Mitochondrial Function, Sperm Motility and Induction of Cell Death. Antioxidants (Basel). 2024;13 (6):. doi:10.3390/antiox13060739

    

翌圣相关产品

产品名称	货号	Ex/Em（nm）
Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit ( flow cytometry) 线粒体膜通透性转换孔检测试剂盒（流式分析）	40756ES	494/517
Calcein, AM, Ultrapure Grade 钙黄绿素，超纯级	40719ES	490/515
Ionomycin, Calcium Salt 离子霉素，钙盐	50401ES	/
MitoTracker Red CMXRos 线粒体红色荧光探针（CAS:167095-09-2）	40741ES	579/599
Hoechst 33342	40731ES	350/461
DMSO 二甲基亚砜（细胞培养级）	60313ES	/
PBS (1×) 细胞培养级	41403ES	/