Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® CUT&Tag建库试剂盒

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产品信息

产品名称

产品编号

规格

Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®

CUT&Tag建库试剂盒(Protein A/G亲和抗体)

12598ES12

12 T

12598ES48

48 T

产品描述

Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台研发的用于CUT&Tag实验的文库构建试剂盒,适用于100-1,000,000个细胞起始量的样本建库CUT&Tag是研究蛋白与DNA互作的技术,相较于传统的ChIP-seqCUT&RUN该技术具有文库构建时更短(仅需7小时)、操作更简单、对起始样本要求更低、抗体投入量更少、文库产量更高等优点。经过细胞捕获、一抗孵育、二抗孵育、转座酶孵育、转座酶激活、掺入DNA标准品、细胞裂解、磁珠回收gDNA、文库扩增和磁珠分选等步骤,靶蛋白结合的DNA片段最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。

试剂盒包含两个独立模块BOX-IBOX-IIBOX-I的核心为结合细胞的ConA磁珠和回收DNA的磁珠BOX-II包含细胞透化剂蛋白酶抑制剂抗体结合buffer转座酶结合buffer蛋白酶K以及后续文库扩增所需的所有试剂。此外,本试剂盒已在不同种类细胞(如293TK562CHOESC细胞等)中进行了验证,均具有良好的建库效率和建库产量。本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库的稳定性和重复性。

产品组分

*测序时 Index 序列 N501-TAGATCGCN701-TAAGGCGA

运输与保存方法

冰袋运输效期一年。

存储温度BOX-I2-8保存BOX-II-20保存切不可弄错!

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离配备文库构建专用移液器等设备以及定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。

5. 操作细胞应尽量轻柔以保持细胞活性。

6. 试剂盒中试剂使用前需颠倒混匀,实验中配置Buffer需要上下颠倒混匀或是旋转仪混匀瞬离后使用

7. 本产品仅用作科研用途!

 

二、应用范围

本试剂盒适用于细胞投入量为100-1,000,000CUT&Tag研究原则上,所有真核生物的新鲜样本或冻存样本都能适用于本试剂盒,但不同的样本类型需要进行不同的样本前处理(如组织样本的单细胞悬液制备、植物样本或者真菌样本的原生质体制备或细胞核悬液制备)后才能按照本实验操作流程进行实验,具体推荐见附录四和附录五。本试剂盒也能应用于单细胞研究

 

三、ConA beads操作注意事项

1. 使用前将磁珠平衡至室温,请勿将磁珠置于0℃以下存放。

2. ConA beads与细胞结合后,应避免剧烈震荡或用力吹打磁珠-细胞复合物使细胞应力损伤导致磁珠与细胞分离。

3. 高细胞投入量(超过50万细胞)在长时间孵育过程中出现部分磁珠聚集为正常现象,以轻弹管底或轻轻吹打使磁珠重悬。

4. 在处理磁珠溶液时应尽量避免高转速离心或长时间置于磁力架上,人为造成磁珠凝集。

5. 避免磁珠长时间暴露在空气中使得磁珠干裂或者磁珠-细胞复合物损伤(不超过3 min

6. 本产品仅用作科研用途!

 

四、关于DNA Selection Beads纯化与分选DNA

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 请勿将磁珠置于0℃以下存放。

4. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

5. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使枪头吸取微量磁珠都将影响后续文库质量。

6. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

7. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3 min足以让磁珠充分干燥。

8. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。

 

五、关于试剂

1. 不同的Buffer试剂应注意保存条件,避免失效。

2. Digitonin有细胞毒性,且容易降解。在溶液配制过程中请做好个人防护。加入Digitonin的溶液应现配现用,在4放置不超过2天。

 

六、文库结构

                                                                                  Index 2 (i5)

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACIIIIIIIITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-NNNNNN-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACIIIIIIIIATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

                                                          Index 1 (i7)

IIIIIIII: Index 2 (i5), 8 basesIIIIIIII: Index 1 (i7), 8 bases-NNNNNN-: 插入序列。

 

 

七、关于抗体选择

CUT&Tag实验中使用的一抗,建议使用ChIP级别或者CUT&TagCUT&RUN实验验证过的抗体,若无法达到抗体要求级别,可以使用IF级别抗体进行实验尝试。

CUT&Tag实验中使用二抗,也会影响实验效果。建议根据一抗种属以及Protein A/G的亲和能力选择无任何标记或修饰(HRPFITC等)的二抗,二抗种属来源以及与Protein A/G的亲和能力进行选择,可以参照以下表格:

物种

抗体亚型

Protein A(Cat#12597)

Protein A/G(Cat#12598)

Human

Total IgG

+++++

+++++

IgG1

+++++

+++++

IgG2

+++++

+++++

IgG3

++

+++++

IgG4

+++++

+++++

IgM

++

++

IgA1

++

++

IgA2

++

++

Mouse

Total IgG

+++++

+++++

IgM

-

-

IgG1

++

++++

IgG2a

+++++

+++++

IgG2b

+++++

+++++

IgG3

+++++

+++++

Rat

Total IgG

++

++++

IgG1

+

+++

IgG2a

-

+++++

IgG2b

-

+++

IgG2c

+++++

+++++

IgG3

++

++++

Rabbit

Total IgG

+++++

+++++

Goat

Total IgG

++

+++++

Sheep

Total IgG

++

+++++

Guinea pig

Total IgG

+++++

+++++

Hamster

Total IgG

++

+++

Donkey

Total IgG

+++

+++++

Pig

Total IgG

+++++

+++++

Dog

Total IgG

+++++

+++++

Cat

Total IgG

+++++

+++++

Cow

Total IgG

++

+++++

Horse

Total IgG

++

+++++

Monkey

Total IgG

+++++

+++++

【注】:+++++代表亲和能力非常强,+++代表亲和能力中等,+代表亲合能力很弱,-代表没有亲合能力。

 

八、关于文库扩增

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司高保真DNA聚合酶所组成,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。

2. 推荐使用本公司的Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (Yeasen Cat#12416)模块进行文库扩增,该模块提供了384种不同组合的双端index文库制备引物,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

3. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、大片段增多、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2和表3列举了在293T细胞中,使用H3K27me3H3K4me3进行文库扩增,细胞投入量扩增循环数以及文库产量之间的关系

2细胞投入量与扩增循环数推荐表(H3K27me3*

细胞投入量

PCR循环数

文库产量

1,000,000

10

700 ng

100,000

13

700 ng

10,000

16

500 ng

1,000

20

500 ng

100

24

500 ng

3 细胞投入量与扩增循环数推荐表(H3K4me3*

细胞投入量

PCR循环数

文库产量

1,000,000

10

500 ng

100,000

13

500 ng

10,000

17

500 ng

1,000

21

500 ng

100

25

500 ng

【注】:*由于不同靶蛋白的表达量、DNA结合能力差异较大。实验中需根据建库起始细胞量、蛋白类型、细胞类型和样本处理情况适当调整扩增循环数。推荐在PCR之前使用qPCR的方法对转座酶插入的片段进行初步定量判断再决定循环数。

 

九、关于DNA标准品

 DNA spike-in mix5 pg/μL)是来源于大肠杆菌 Lambda DNA的三段序列,长度分别为230 bp250 bp300 bp,摩尔浓度比约为1310(见图1)。标准品主要用于在不同处理条件下或者不同细胞状态下测序数据Normalization和定量分析10万投入量细胞加入1 μL即可,也可根据靶蛋白的结合DNA能力和丰度自行调整。标准品序列:

 

十、关于文库质检

1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®PicoGreen®以及基于qPCR绝对定量的方法。

3. 文库长度分布检测,可通过QsepAgilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

十一、自备材料

1. 抗体:靶蛋白的一抗和相对应的二抗。

2. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品文库定量试剂。

3. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

4. Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®Cat#12416)或其他替代引物。

使用方法

一、细胞准备

1. 在室温条件下收集细胞并计数,死亡的细胞染色质松散,暴露出大量的裸DNA,转座酶复合物随机切割会造成比较强的噪音信号,建议样本细胞活性不低于80% (细胞活性可以用台盼蓝染色来鉴定)

2. 贴壁较紧的细胞如Hela细胞等可用Accutase或者Trypsin部分消化获得。

3. 植物或真菌细胞可通过特殊处理获得原生质体或细胞核进行实验,方法可参考附录四。

4. 新鲜或者冻存的动物组织可通过特殊处理获得细胞/细胞核悬液进行实验,方法可参考附录四附录五。

 

二、操作流程

三、操作步骤

 

请在实验前仔细阅读本操作说明,本试剂盒在步骤3.3(结合一抗、二抗和转座酶)提供两种操作方法:操作方法3.3-A3.3-B。操作方法3.3-A将二抗与pA/G-Tn5提前孵育,整体实验时长缩短为6 h;操作方法3.3-B为常规实验流程,整体实验时长为7.5 h。两种实验流程都经过了长期测试,结果产出稳定,可以选择任一实验流程进行实验操作。

3.1 溶液配制(0.5 h

【注】含有Digitonin的缓冲液不可长期保存,请根据实际样本数量现配现用,配制的buffer室温放置。如需过夜,则存储在4℃,使用时需至少提前10 min取出恢复至室温。本操作中溶液配制量为单个样本单次实验所需的buffer用量,请根据实际样本数调整buffer配制量。

1. 提前10 min取出ConA bind buffer Cell wash buffer Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) 5% Digitonin,待恢复到室温后,颠倒10后瞬离。

2. BF1900 μL Cell wash buffer加入9 μL Protease Inhibitor Cocktail ( EDTA-free) ,混匀后瞬离。

3. BF2250 μL BF1,加入2.5 μL 5% Digitonin,混匀后瞬离。

4. BF3400 μL BF1,加入0.8 μL 5% Digitonin20 μL 3M NaCl,混匀后瞬离。

5. BF4实验组BF4+48.5 μL BF2,加入1 μL 50× Protein blocker0.5 μL一抗(抗体说明书推荐使用浓度进行稀释,本配方为1100稀释比),混匀后瞬离

阴性对照组BF4-49 μL BF2,加入1 μL 50× Protein blocker或取48.5 μL BF2,加入1 μL 50× Protein blocker0.5 μL IgG一抗,混匀后瞬离

3.2 细胞捕获(0.5 h

1. 细胞准备:

a在室温下收获细胞并计数,取100-1,000,000个细胞1.5 mL EP管中,室温600 × g离心5 min,吸管内溶液

b加入140 μL BF1,轻轻吹打重悬室温600 × g离心5 min,吸管内溶液;

c加入90 μBF1,轻轻吹打重悬,转移至PCR管中。

:对于大小不同的细胞,请根据实际情况调整离心力)

2. 磁珠活化:颠倒或轻轻旋涡振荡混匀Con A Beads4T小包装磁珠体积较小,可以瞬离后用移液枪吹吸10次混匀)

a10 μL Con A Beads于已预加40 μL ConA bind bufferPCR管中吹吸混匀,静置于磁力架至磁珠贴壁,吸管内溶液;b取下PCR管,加入50 μL ConA bind buffer,吹吸混匀,静置于磁力架至磁珠贴壁管内溶液

c)再次取下PCR管,加入10 μL ConA bind buffer,吹吸混匀

3. 活化后的磁珠与细胞结合:将重悬在ConA bind buffer中的ConA beads轻轻滴加在细胞悬液中,上下颠倒5次混匀后,将PCR管置于旋转仪上混匀5-10 min

3.3 -A结合一抗二抗和转座酶(2.5 h 

【注】:结合细胞后的磁珠需要轻柔操作,避免剧烈涡旋导致细胞损伤建议上下颠倒或者用平口枪头轻轻吹吸等方式混匀避免产生大量气泡避免磁珠在磁力架上放置时间过长和直接暴露在空气中时间过长(不超过3 min)造成磁珠结块及细胞破裂。

1.将与细胞结合好的磁珠取下,瞬离(< 100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min管内溶液

2.加入50 μL BF4+/BF4-用移液器轻轻吹打混匀。

3.室温下旋转孵育2 h或者4 °C旋转孵育过夜最好水平旋转,保证液体在管底。每隔30 min可轻弹底部混匀,避免磁珠聚集干结

:需同时完成步骤4的操作

4. 在一抗孵育的同时,配制二抗与转座酶预孵育的mix48.5 μL BF3加入0.5 μL二抗再加入1 μL转座酶mix(常规推荐二抗稀释比例为1100),轻轻涡旋或轻弹底部混匀,室温下旋转孵育1.5-2 h

5. 步骤3与一抗结合好的磁珠取下,瞬离(< 100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min管内溶液。

6. 用步骤4中的转座酶-二抗结合液重悬步骤5中磁珠,室温旋转孵育0.5 h最好水平旋转保持液体在管底。

a将结合好的磁珠取下,瞬离(<100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min),吸去PCR管中全部液体。加入100 μL BF3轻轻点动涡旋用移液器吹打10,充分分离磁珠及细胞

b) 瞬离(<100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min),吸去PCR管中全部液体。加入100 μL BF3轻轻点动涡旋用移液器吹打10,充分分离磁珠及细胞

c) 瞬离(<100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min),吸去PCR管中全部液体。加入100 μL BF3轻轻点动涡旋用移液器吹打10,充分分离磁珠及细胞

一共清洗磁珠3次。

7.立即进行步骤3.4(转座酶激活)。

3.3-B 结合一抗二抗和转座酶(3.5 h

【注】:结合细胞后的磁珠需要轻柔操作,避免剧烈涡旋导致细胞损伤建议上下颠倒或者用平口枪头轻轻吹吸等方式混匀,避免产生大量气泡,避免磁珠在磁力架上放置过长时间和直接暴露在空气中时间过长(不超过3 min)造成磁珠结块及细胞破裂。

  1. 将与细胞结合好的磁珠取下,瞬离(< 100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min管内溶液
  2. 加入50 μL BF4+/BF4-用移液器轻轻吹打或轻轻点动涡旋混匀10
  3. 室温下旋转孵育2 h或者4 °C旋转孵育过夜最好水平旋转,保证液体在管底。每隔30 min可轻弹底部混匀,避免磁珠聚集干结。
  4. 将与一抗结合好的磁珠取下,瞬离(< 100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min管内溶液。
  5. 加入49.5 μL BF2后,再加入0.5 μL二抗(常规推荐二抗稀释比例为1100),轻轻点动涡旋或轻弹底部混匀10(若样品较多,二抗结合液可一起提前配制)
  6. 室温下旋转孵育0.5 -1 h最好水平旋转,保证液体在管底。每隔30 min轻弹底部或者用移液器轻轻吹打,避免磁珠聚集干结。

a将与二抗结合好的磁珠取下,瞬离(< 100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min管内溶液。加入65 μL BF2,轻轻点动涡旋用移液器吹打10次,充分分离磁珠及细胞。

b瞬离(< 100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min),吸管内溶液。再加入65 μL BF2,轻轻点动涡旋用移液器吹打10次,充分分离磁珠及细胞。

一共清洗磁珠两次

7. 将磁珠瞬离(<100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min),吸管内溶液。

8. 加入49 μL BF3后,再加入1 μL pA/G-Transposome Mix用移液器吹打轻轻点动涡旋混匀10(若样品较多,Transposome结合液可一起提前配制)

:不同的实验环境,转座酶的切割活性可能不同,请根据实际情况,在此基础上调整转座酶的使用浓度。本试剂盒中转座酶复合物的浓度为2.5 μM)。

9. 室温下旋转孵育1 h最好水平旋转,保证液体在管底。每隔30 min轻弹底部混匀,避免磁珠聚集干结。

(【:转座酶孵育可能会导致轻微的磁珠板结。孵育太久(超过3 h)会造成转座酶非特异性结合到DNA上,增强了背景噪音)。

a瞬离(<100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min管内溶液加入100 μL BF3轻轻点动涡旋移液器吹打10,充分分离磁珠及细胞。

b瞬离(<100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min管内溶液加入100 μL BF3轻轻点动涡旋移液器吹打10,充分分离磁珠及细胞。

c瞬离(<100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min管内溶液加入100 μL BF3轻轻点动涡旋移液器吹打10,充分分离磁珠及细胞。

一共清洗磁珠3次。

10.立即进行步骤3.4(转座酶激活)

3.4 转座酶激活(1 h

1. 将磁珠瞬离(<100 × g),静置于磁力架至磁珠贴壁(不超过2 min管内溶液加入 30 μL BF3,再加入1 μL 30× Activating buffer轻轻吹打点动涡旋混匀10(若样品较多,激活缓冲液可一起提前配制)

2. 37 °C旋转孵育1 h最好水平旋转,保证液体在管底或置于PCR仪中,热盖50℃on37℃ 1 h。每隔30 min轻弹底部混匀,避免磁珠聚集干结。

3.5 蛋白酶K消化和基因组DNA回收(1 h

1. 向每个样品中加入2 μL 15× Terminate Solution1 μL DNA Spike-in mix1 μL 30× Proteinase K(此时磁珠会板结)(若样品较多,可一起提前配制)。全速涡旋样品约10 sec,混匀后瞬离,将样品置于PCR仪,55 ºC消化30 min (热盖不低于70 ºC)或者37 ºC过夜。

2. 短暂离心(<100 × g),将PCR置于磁力架上静置3 min,取30 μL上清。

DNA Spike-in mix主要用于不同处理条件或者细胞状态下的测序数据Normalization和定量分析,为非必需加入的组分。客户可根据实验需要判断是否加入DNA Spike-in mix10万投入量细胞加入1 μL即可,也可根据靶蛋白的结合DNA能力和丰度自行调整。具体请参见注意事项。)

3. 加入40 μL室温下平衡的DNA Selection Beads涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置孵育5 min

4. 短暂离心(<100 × g),将PCR置于磁力架上静置3 min,待磁珠完全贴壁后管内溶液

5. 保持PCR管始终处于磁力架从另一侧加入200 μL 80乙醇,避免直接冲刷磁珠,静置30-60 sec管内溶液

6. 保持PCR管始终处于磁力架,再次加入200 μL 80%乙醇,静置30-60 s管内溶液

7. 保持PCR管始终处于磁力架开盖空气干燥至磁珠刚刚出现龟裂(不超过3 min)。

8. 从磁力架上取下PCR,加入21 μL ddH2O,并充分涡旋室温静置5 min

9. PCR管短暂离心置于磁力架分离磁珠和液体待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至新的EP管中,-20℃保存。

3.6 文库扩增

1. 将表4中试剂解冻后颠倒混匀,瞬离后置于冰上备用

2. 于无菌PCR管中配制表4所示反应体系。

4 PCR扩增反应体系

名称

体积(μL

步骤3.5纯化产物

20

PCR Primer Mix

3

N5XX*

1

N7XX*

1

 Ultima Amplification Mix

25

ddH2O

Up to 50 μL

*Hieff  NGS® Tagment Index Kit for Illumina® Cat#12416中提供N5XXN7XX,可根据样品数量和Index选择策略自行选择。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. PCR管置于PCR仪中,设置表5所示反应程序,进行PCR扩增

5 PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

热盖105℃

On

 

72°C

3 min*

——

95°C

30 sec

——

95°C

10 sec

n cycles**

55°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

——

4°C

Hold

——

【注】*此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链DNA72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

**由于不同靶蛋白的表达量、DNA结合能力差异较大。实验中需根据建库起始细胞量、蛋白类型、细胞类型和样本处理情况适当调整扩增循

环数。推荐在PCR之前使用qPCR的方法对转座酶插入的片段进行初步定量判断再决定循环数。组蛋白修饰作为靶蛋白所使用的PCR循环数

可参考表2和表3

3.7 文库纯化

1. 将平衡至室温的DNA Selection Beads磁珠,振荡或上下颠倒混匀。

2. 吸取60 μL1.2×DNA Selection Beads至步骤3.6PCR反应产物中,涡旋混匀或移液器吹打混匀10次,室温静置孵育5 min

2. 短暂离心(<100 × g),将离心管置于磁力架上静置3 min,待磁珠完全贴壁后PCR管中溶液。

3. 保持PCR管始终处于磁力架从另一侧加入200 μL 80%乙醇,避免直接冲刷磁珠,静置30-60 secPCR管中溶液

4. 保持PCR管始终处于磁力架中,再次加入200 μL 80%乙醇,静置30-60 secPCR管中溶液

5. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖空气干燥至磁珠刚刚出现龟裂(不超过3 min)。

6. 从磁力架上取下PCR,加入21 μL ddH2O,并充分涡旋室温静置5 min

7. PCR管短暂离心并置于磁力架分离磁珠和液体待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至EP管中,于-20℃保存。

8. 如需获得长度分布更集中的文库扩增产物,可使用胶回收或者磁珠分选的方式进行长度分选和纯化。文库大小可使用Agilent 2100 BioanalyzerQsep或者凝胶电泳进行检测。

3.8 文库分选(根据靶蛋白抗体选择)

由于抗体的结合效率、不同靶蛋白在染色质上结合区域的差异以及不同种类细胞的染色质开放状态差异,文库大小可能存在不同的分布模式。通过磁珠分选,文库中的大片段可以有效去,使得文库主峰约520 bp,即两个核小体保护DNA长度的插入片段。客户可根据构建的文库分布情况自行决定是否需要进行磁珠分选。

1. 进行双轮分选时,需将初始DNA样本用ddH2O补齐至100 μL并转移至新的PCR管中,加入60 μL (0.6×)室温下平衡的DNA Selection Beads涡旋混匀或移液器吹打混匀10次,室温静置孵育5 min

3. 短暂离心(<100 × g),将PCR管置于磁力架上静置5 min,待溶液澄清后,小心转移上清至新PCR管中(残留3-5 μL避免吸到磁珠)。

4. 加入50 μL (0.5×)室温下平衡的DNA Selection Beads涡旋混匀或移液器吹打混匀10次,室温静置孵育5 min

5. 短暂离心(<100 × g),将PCR置于磁力架上静置3 min,待磁珠完全贴壁后吸PCR管中溶液。

6. 保持PCR管始终处于磁力架从另一侧加入200 μL 80乙醇,避免直接冲刷磁珠,静置30-60 secPCR管中溶液

7. 保持PCR管始终处于磁力架,再次加入200 μL 80%乙醇,静置30-60 secPCR管中溶液

8. 保持PCR管始终处于磁力架开盖空气干燥至磁珠刚刚出现龟裂(不超过3 min)。

9. 从磁力架上取下PCR,加入21 μL ddH2O,并充分涡旋室温静置5 min

10. PCR管短暂离心置于磁力架分离磁珠和液体待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至EP管中,于-20℃保存。

3.9 文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项。

附录

一、组蛋白修饰H3K27me3H3K4me3 DNA结合图谱建库

使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAbCell Signaling Technology Cat#9733)、Histone H3K4me3 antibody (pAb)Active Motif Cat# B_2615077)和Normal Rabbit IgGCell Signaling Technology Cat#2729)作为一抗、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗(antibodies-online Cat#ABIN101961使用Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®100-1,000,000293T细胞投入量样本建库,并分别使用1.2×磁珠进行纯化,再使用0.6×0.4×磁珠分选,文库大小结果使用Qsep2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

3  Qsep和琼脂糖凝胶电泳进行文库质量分析

 

二、不同细胞投入量的H3K27me3 DNA结合图谱建库测序

使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb作为一抗(Cell Signaling Technology Cat#9733)、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗(antibodies-online Cat#ABIN101961使用Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®100-1,000,000293T细胞投入量样本建库,并分别使用1.2×磁珠进行纯化,结果使用Qsep进行检测。文库测序后与ENCODE中的H3K27me3 ChIP-seq数据进行比较。

4  Qsep对不同细胞投入量文库质量分析

5  利用本试剂盒鉴定不同细胞投入量条件下H3K27me3在染色质上的信号分布和相关性

 

三、不同细胞投入量的H3K4me3 DNA结合图谱建库测序

使用Histone H3K4me3 antibody (pAb)作为一抗(Active Motif Cat# B_2615077Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗(antibodies-online Cat#ABIN101961使用Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®100-1,000,000293T细胞投入量样本建库,并分别使用1.2×磁珠进行纯化,结果使用Qsep进行检测。文库测序后与ENCODE中的H3K4me3 ChIP-seq数据进行比较。

6  Qsep对不同细胞投入量文库质量分析

7  利用本试剂盒鉴定不同细胞投入量条件下H3K4me3在染色质上的信号分布和相关性

 

四、植物组织细胞核的分离。

4.1 溶液配制(0.5 h

  1. 提前10 min取出ConA bind buffer Cell wash buffer Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) 5% Digitonin,待恢复到室温后,颠倒10次混匀后瞬离。
  2.  BF1:取900 μL Cell wash buffer加入9 μL Protease Inhibitor Cocktail ( EDTA-free) ,混匀后瞬离。
  3.  BF2:取250 μL BF1,加入2.5 μL 5% Digitonin,混匀后瞬离。
  4.  BF3:取400 μL BF1,加入0.8 μL 5% Digitonin20 μL 3M NaCl,混匀后瞬离。
  5.  BF4实验组 BF4+48.5 μL BF2,加入1 μL 50× Protein blocker0.5 μL一抗(抗体说明书推荐使用浓度进行稀释,本配方为1100稀释比),混匀后瞬离
  6. 阴性对照组BF4-49 μL BF2,加入1 μL 50× Protein blocker或取48.5 μL BF2,加入1 μL 50× Protein blocker0.5 μL IgG一抗,混匀后瞬离
  7. 核提取液缓冲液A10 mM Tris pH 8.010 mM KCl0.5 mM spermidine
  8. 核提取液缓冲液B0.25 M 蔗糖、10 mM Tris pH 8.010 mM MgCl21% Triton X-1005 mM β-巯基乙醇、0.1% Protease Inhibitor Cocktail
  9. 核提取液缓冲液C1.8 M 蔗糖、10 mM Tris pH 8.02 mM MgCl20.15% Triton X-1005 mM β-巯基乙醇、0.1% Protease Inhibitor Cocktail
  10. 核提取液缓冲液D10 mM Tris pH 8.0150 mM NaCl0.5 mM spermidine0.1% Protease Inhibitor Cocktail

4.2 植物细胞核分离和捕获(2 h

为避免叶绿体或线粒体等细胞器DNA产生的数据背景,我们建议对植物组织进行细胞核提取处理。

  1. 称取0.2 g新鲜植物组织(如叶片等),用剪刀将样品剪成碎片后置于5 cm 塑料培养皿中,加入核提取缓冲液A(不能加太多缓冲液,刚刚能浸湿样品即可),用刀片轻而快的切样品直至样品看不见颗粒为止(泥状或卵状)(若样本冻存时间较长,需要进行液氮研磨,即称取0.2 g冻存样本,加入液氮充分研磨成冻干粉末,将研磨好的粉末用6 mL预冷的核提取液A重悬并转移至15 mL离心管中,颠倒震荡混匀)
  2. 40 μm 滤器(建议尽量用能适配15 mL EP管的滤器,过大造成样品损失)过滤步骤1中的溶液,步骤1培养皿中有剩余样品可以吸取核提取缓冲液A少量多次冲洗并将冲洗液继续过滤
  3. (可选)流式分选:有流式分选条件的单位,用DAPI对核悬液进行染色,流式分选细胞核之后按照操作步骤3.3开始进行实验
  4. 不能进行流式分选时,将步骤 2 中样品 4 12000 × g 离心5 min,吸净管内液体。若步骤 2 中样品有很多色素,用 1 mL核酸提取液B重悬后,4℃12000 × g 离心5 min,重复多次,直至无色素或色素颜色较弱。
  5. 用核酸提取液C重悬步骤 4 中沉淀。
  6. 另取一个新的 1.5 mL EP 管,在EP管中加入 500 μL核酸提取液C
  7. 将步骤5中重悬液沿着步骤6EP管管壁缓缓加入使步骤5中悬液置于步骤6悬液上方,避免两步骤中溶液混合。
  8. 4℃ 12000 × g离心45 min
  9. 弃上清,加入1 mL核提取缓冲液D重悬沉淀后,4℃ 2000 × g离心5 min,去掉上清。重复三次后,用90 μL核提取缓冲液D重悬沉淀并转移到PCR管中。

4.3 磁珠活化步骤:10 μL Con A磁珠于已预加40 μL ConA bind bufferPCR管中吹吸混合,静置于磁力架至磁珠贴壁,吸除管内全部溶液;取下PCR管,加入50 μL ConA bind buffer,吹吸混合,静置于磁力架至磁珠贴壁;吸除管内全部溶液,取下PCR管,加入10 μL ConA bind buffer,吹吸混合。

4.4磁珠与细胞核结合:将重悬在ConA bind buffer中的珠浆轻轻滴加在细胞核悬液中,上下颠倒5次混匀后,将PCR管置于旋转仪上混匀5-10 min

按照3.3开始进行实验(不需要进行3.2步骤)。

 

五、动物组织细胞的分离。

5.1 溶液配制(0.5 h

  1. 提前10 min取出ConA bind buffer Cell wash buffer Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) 5% Digitonin,待恢复到室温后,颠倒10次混匀后瞬离。
  2. BF1:取900 μL Cell wash buffer,加入9 μL Protease Inhibitor Cocktail ( EDTA-free) ,混匀后瞬离。
  3. BF2:取250 μL BF1,加入2.5 μL 5% Digitonin,混匀后瞬离。
  4. BF3:取400 μL BF1,加入0.8 μL 5% Digitonin20 μL 3M NaCl,混匀后瞬离。
  5. BF4实验组 BF4+:取48.5 μL BF2,加入1 μL 50× Protein blocker0.5 μL一抗(按抗体说明书推荐使用浓度进行稀释,本配方为1100稀释比),混匀后瞬离。
  6. 阴性对照组BF4-49 μL BF2,加入1 μL 50 × Protein blocker(或取48.5 μL BF2,加入1 μL 50× Protein blocker0.5 μL IgG一抗,混匀后瞬离。
  7. 细胞缓冲液A20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidine

5.2 动物细胞分离和捕获(1 h

  1. 称取0.2 g新鲜动物组织(黄豆粒大小),用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体(或加入液氮充分碾磨成冻干粉末)。将碾磨好的样品使用6 mL预冷的细胞缓冲液A悬浮并转移至15 mL离心管中,颠倒震荡混匀。
  2. 使用100-200目筛网对细胞悬液进行过滤处理(若起始材料较少,可以不经过此操作步骤)。
  3. 使用平口或者剪刀剪平的移液枪头将细胞核悬液分装至1.5 mL离心管中,每管1 mL4℃ 600 × g离心5 min吸除管内全部溶液140 μL BF1重悬全部沉淀,室温600 × g离心5 min,吸除上清。

:对于大小不同的细胞,请根据实际情况调整离心力)

  1. 加入90 μL BF1,轻轻吹打重悬,转移至PCR管中。

5.3 磁珠活化步骤:10 μL Con A磁珠于已预加40 μL ConA bind bufferPCR管中吹吸混合,静置于磁力架至磁珠贴壁,吸除管内全部溶液;取下PCR管,加入50 μL ConA bind buffer,吹吸混合,静置于磁力架至磁珠贴壁;吸除管内全部溶液,取下PCR管,加入10 μL ConA bind buffer,吹吸混合。

5.4 磁珠与细胞结合:将重悬在ConA bind buffer中的珠浆轻轻滴加在细胞悬液中,上下颠倒5次混匀后,将PCR管置于旋转仪上混匀5-10 min

按照3.3开始进行实验(不需要进行3.2步骤)。

HB221028

400-6111-883