干货 | WB实验指南：蛋白定量操作指南及注意事项
蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是一种常用于蛋白质分析的技术手段，其核心流程包括通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品进行分离，随后将蛋白转移至固相膜上，并利用特异性抗体（通常为一抗与二抗的复合物）对目标蛋白进行检测。该方法因其高灵敏度和良好的特异性，已成为生命科学研究中应用最广泛的蛋白检测技术之一。
Western Blot 实验必须做蛋白定量，是因为只有先准确测定每个样本的总蛋白浓度，才能确保各泳道上样量完全一致，从而把后续检测到的条带信号差异真正归因于生物学变化，而不是因上样不均、电泳转膜效率不同或内参饱和等技术误差造成的“假象”，这是数据可重复、统计有效和结论可信的根本前提。
蛋白定量有哪些方法？
蛋白质种类很多，结构、功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量的方法带来了许多困难。目前依据不同的原理，已经出现多种蛋白定量的方法。
总蛋白定量的方法主要有Bradford法，BCA法，紫外分光光度法，lowry法等。本篇主要和大家讨论一下Bradford法和BCA法。
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货号 |
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名称 |
BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型) |
BCA蛋白浓度测定试剂盒(即用型) |
Bradford蛋白浓度测定试剂盒 |
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吸收波长 |
562 nm |
595 nm |
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原理 |
基于双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，产生一种紫蓝色复合物，在562 nm处有高的吸光值，该反应产物的量与蛋白质浓度成正比。 |
Bradford染液（考马斯亮蓝G-250染料）与蛋白结合，使染料的最大吸收峰从A456变为A595，且测定的吸光值与蛋白浓度成正比 |
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检测灵敏度 |
最小检测蛋白量可达0.2 μg，检测浓度下 限达到10 μg/mL |
1~5 μg |
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时间 |
中速10-20 min |
快速5-15 min |
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优点 |
兼容去污剂和变性剂，变异低 |
在20201ES的基础上提供即用型标准品，省去繁琐的稀释步骤。 |
兼容还原剂，快速 |
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缺点 |
低或不兼容还原剂，需手动稀释标准品 |
低或不兼容还原剂 |
低兼容去污剂 |
BCA法和Bradford法均需制作标准曲线，需要注意：
因为显色反应与温度和时间的变化有关，为了尽可能准确测定未知样品中的总蛋白浓度，建议每次进行分析时都应制作标准曲线。
超出标曲范围内的数值无法确定，务必保证样品数据在标准曲线范围内。
为了减小误差，建议做3个复孔。
怎么选择定量的方法？
要根据样品的组份，定量的区间，反应的时间，仪器设备等综合判断分析，选择最合适的方法。主要看样品中去垢剂，如果你的蛋白抽提试剂含有大量去垢剂，请选择BCA法。如果你的样品中含有EDTA等金属螯合剂(BCA法中Cu离子被螯合)，或者含有还原性，建议选择Bradford法。如用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定其蛋白浓度。可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其蛋白浓度。
操作步骤
以BCA发测蛋白浓度为例：
蛋白提取步骤见前文WB实验指南！蛋白提取操作指南及注意事项，提取得到的蛋白溶液中蛋白浓度通常会大于标曲范围，建议对样品进行梯度稀释如：5倍稀释、10倍稀释、20倍稀释等。
配置BCA工作也：计算所需的BCA工作液总量，将BCA试剂A与试剂B以50:1的比例混合。
在96孔板中加入即用型标准品或梯度稀释的标准品以及待测样品各25 μL。标曲的浓度应范围建议在20-2000 μg/μL。
加入200 μL BCA工作液。振荡30s充分混匀，37℃孵育30min。
冷却到室温，在酶标仪上的540-595 nm波长范围处检测吸光度，其中562 nm波长为最佳。
制作标准曲线，并计算样品浓度：观察测得OD值的每个复孔数值，是否有偏移较大的，如果有，去除该数值，或者去除这个检测点。计算平均值：计算各个浓度标准品以及样品OD值的平均值。输入标准品的对应的浓度，选中标准品OD值和标准品浓度，插入散点图，添加趋势曲线。右击趋势线，选择趋势线格式，选勾显示公式（E）以及显示R平方值。则在图表标题中显示出公式和R2值来。一般R2值越接近1代表你的标准曲线做得越好，根据标准曲线带入的样品OD值测出的蛋白浓度也越准确。R2值一般要求大于等于0.99。计算样品浓度。将样品OD值代入标准曲线的公式中，推导即得到待测样品蛋白的浓度。如果检测样品是稀释后的样品，则实际浓度需要乘以对应的稀释倍数。
注意：公式中X,Y分别代表是什么，以及浓度的单位！
常见问题
至少预实验的时候建议做蛋白定量。虽然蛋白定量主要目的是对样品进行均一化处理，保证上样量一致。但是另一个作用优化上样量，也十分重要。上样量太低，目标蛋白可能检测不到；上样量太高有可能导致过曝，灰度值分析误差大。有文献报道总蛋白上样量超过10 μg/孔时内参蛋白不够敏感，无法检测到差异。内参蛋白理想的上样量5 μg以内，目标蛋白的上样量为10-20 μg。
首先，蛋白定量环节：注意样品中是否含有干扰物质，选择适合的定量方法；检测的值是否在线性范围内；做复孔，减小误差。
其次，转膜环节：注意转膜的均一。
最后，注意内参蛋白的选择是否合适。比如GAPDH是常用的内参蛋白，但是GAPDH是糖酵解过程中的一个酶，在缺氧，糖酵解紊乱等情况会增加GAPDH在特定细胞中的表达。内参蛋白要选表达不受实验处理影响的蛋白。
现在也有很多人用总蛋白作为内参，即通过考马斯亮蓝（G250-Cat#20203ES、R250-Cat20310ES）或者丽春红（Cat#60758ES）染总蛋白，翌圣推出PAGE凝胶快速制备试剂盒（10%，免染版）（Cat#20337ES），也可以准确反应每个泳道中的蛋白量，可以作为WB的可靠内参。
样品提取时，组织样品可以通过称量，细胞样品可以通过计数，等比例加入提取液。这样各组样品浓度差异就不会非常大了。
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名称 |
货号 |
规格 |
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BCA Protein Quantification Kit（Ready to use） BCA蛋白浓度测定试剂盒(即用型) |
500 T |
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BCA Protein Quantification Kit BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型） |
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Bradford Protein Quantification Kit Bradford蛋白浓度测定试剂盒 |
500 T（125 mL）/ 2500 T（625 mL） |
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Coomassie Brilliant Blue G250 考马斯亮蓝G250 |
10 g |
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Coomassie Brilliant Blue R250 考马斯亮蓝R250 |
10 g/25 g |
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25 mL |
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Commassie Blue Fast Stain Solution (8 mins) 考马斯亮蓝快速染色液（8分钟） |
8 mL |
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Protein Silver Stain Kit 蛋白质银染试剂盒 |
25 T |
