类器官传代标准化操作全攻略：解锁稳定扩增的秘诀！
类器官技术作为前沿生物模型，在疾病研究、药物筛选和个性化医疗等领域展现出巨大潜力。然而，传代过程中的技术瓶颈始终是影响实验可重复性的关键因素。本文将系统解析类器官传代的标准操作流程，助力研究人员实现类器官的稳定扩增！
1.形态学标准：
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类器官直径达200–500 μm（人源偏大，鼠源偏小），边缘光滑、无中心黑化或空泡。
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特定类器官需结合功能标志：1）食管类器官：培养第9–14天出现“角化珠”为传代窗口；2）肠/胰腺类器官：分支或“菜花状”突起提示成熟，但非必需指标；3）神经类器官：需通过β-III tubulin染色或电生理活性验证。
2.功能与生长指标：
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生长速率日增幅<5% 或培养基48小时内变黄，需立即传代；分泌标志物阳性率≥20%（如肠类器官MUC2⁺杯状细胞）。
1. 试剂与耗材的预冷处理
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基质胶：4°C冰箱冰上过夜解冻，避免反复冻融（>2次可能导致胶强度下降>30%）。
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耗材全程预冷：枪头、离心管、PBS需冰上预冷≥30分钟，防止操作中胶体提前聚合。
2.胶回收
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吸弃培养基，沿孔壁加入4°C预冷PBS轻柔冲洗2次，水平摇床30 rpm震荡30秒，彻底去除残留胶碎片。
3.消化解离：
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机械法：适用于正常上皮或脆弱组织，200μL枪头轻吹5-10次，经100μm滤网过滤。
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酶消化法：每孔加入200 μL 4°C预冷的Accutase或TrypLE™，室温静置5–7分钟（致密肿瘤组织可延长），镜下观察至类器官边缘“起毛变亮”时，立即加入等体积含10% FBS的冰培养基终止消化。
4.清洗与离心
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收集悬液至15 mL离心管，4°C、200×g离心5分钟，弃上清后再用1 mL预冷PBS重悬离心一次，彻底去除FBS。
5.重胶与接种
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细胞沉淀与基质胶按1:3（v/v）混合，确保终浓度≥70%（浓度<60%易导致3D结构塌陷）；每孔取20 μL混合液垂直悬空滴于预热的24孔板中央，37°C固化15分钟，沿侧壁缓慢加入500 μL完全培养基。
1.碎片大小筛检
机械分散后过 100 μm 滤网，弃 <50 μm 碎片；小碎片类器官形成率仅 10–15 %。
2.48 h 不换液
传代后前 48 h 不换液，保留自分泌因子；提前换液可使重建效率下降约30 %。
3.排出气泡
胶内气泡区缺氧坏死率 100 %；若出现 >200 μm 气泡，用 10 μL 枪头轻挑边缘排出。
正常肠/胃：1:4（酶解+轻吹，回收率80–90 %），肿瘤首代：1:2（酶解，回收率60–70 %），致密实体瘤二次：1:6（机械剪切，回收率50–60 %）。
1.无出芽
提高接种密度至≥30团/孔，确保胶浓度≥70%。
2.中心黑化
控制胶滴厚度≤200μm，彻底排除气泡。
3.培养基快速变黄
优化消化时间，降低离心力至200g。
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