HieffNGS®C130P2OnePotIIDNALibraryPrepKitforMGI®是针对MGI®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法 建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，将片段化 模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基 因组、微生物基因组等样本，同时能兼容FFPEDNA样本的建库。经测序验证，不同GC含量的样本，均可获得优异的测 序结果，文库覆盖度高，均一性好，偏好性低，使建库变得更加简单高效。 ➢适用10ng-1μg的基因组DNA、全长cDNA等样本 ➢高质量片段化酶，可随机切割双链DNA，酶切片段无偏好性 ➢片段化、末端修复/加A一步完成 ➢强扩增效率的高保真酶，显著提高文库质量及产量 ➢适用于FFPEDNA样本 ➢严格的批次性能与稳定性质控 产品组分 组分编号与名称13509ES1613509ES96 13509-ASmearase®Mix160μL960μL 13509-BLigationEnhancer480μL4×720μL 13509-CFastT4DNALigase80μL480μL 13509-D2×UltimaHFAmplificationMix400μL4×600μL 13509-EPrimerMixforMGI®80μL480μL
干冰运输。所有组分-20°C保存，有效期1年。 注意事项 一、关于操作 1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。 3.配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。 4.为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。 5.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。 6.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检 测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂 进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。 7.本产品仅用作科研用途！ 二、关于DNA片段化 1.本试剂盒兼容范围为10ng–1μgInputDNA。应尽可能使用A260/A280=1.8-2.0的高质量InputDNA。 2.若InputDNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响后续实验，建议将DNA稀释在ddH2O或不含EDTAYeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第2页，共8页 的10mMTrisBuffer(pH7.5-8.0)中进行片段化。 3.对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间参考表5，本试剂盒片段化偏好低，耐受各种GC含量的模板。对于不同降解 程度的FFPE样本，酶切时间参考表6。以上为推荐时间，需客户在自己的实验体系中进行微调，以达到最佳效果。 4.为保证优质精确的片段化效果，片段化反应配制过程请于冰上操作。 5.针对FFPEDNA建库，若样本质量不佳，客户对当前建库产量不满意，可选购我公司的FFPEDNARepairReagent (Cat#12606)对FFPEDNA进行修复，具体使用方法可参考此产品说明书。该试剂可与片段化末修加A过程同时进行，无需 额外的操作。 三、关于接头连接（AdapterLigation） 1.目前华大智造有2种序号的接头：1-128和501-596。关于其使用要求，请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨 询本公司。此外，华大智造申明：2种接头由于设计工艺不同，禁止混用，否则测序数据无法拆分！ 2.Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。请按照表1和实际DNA投入量确实确定接头用量，需要稀释 接头时，请用TEbuffer对接头进行稀释。 表110ng-1μgInputDNA推荐的Adapter使用浓度 InputDNA10μMAdapter稀释倍数稀释后投入量（μL） 31ng-1μg不稀释5 10-30ng55 四、关于磁珠纯化与分选（Bead-basedCleanUpandSizeSelection） 1.DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。 2.当InputDNA质量≥50ng，您可选择在接头连接后分选；如InputDNA质量<50ng，建议您在文库扩增后进行分选。 3.LigationEnhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行 纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。 4.磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。 5.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。 6.转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。 7.磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。 8.进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。 9.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而 降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5min足以让磁珠充分干燥。 10.DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TEBuffer洗脱，产物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1个月。 五、关于文库扩增（LibraryAmplification） 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度 增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒，获得1μg文库的推荐循环数。 表210ng-1μgInputDNA获得1μg产物扩增循环数推荐表 InputDNA（ng）Numberofcyclesrequiredtogenerate 1μg 1μg3-5 500ng4-6 200ng5-7 50ng8-10 10ng10-12 【注】：建库过程中若进行片段分选，扩增时请参照较高循环数扩增。 六、关于文库质检（LibraryQualityAnalysis） 1.通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第3页，共8页 2.文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。 3.文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。 4.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法，无法有效区分 单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理， 仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。 5.文库长度分布检测，可通过AgilentBioanalyzer2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。 使用方法 一、自备材料 1.纯化磁珠：Cat#12601，HieffNGS®DNASelectionBeads或Cat#A63880，AMPureXPBeads或其他等效产品。 2.DNA质控：AgilentTechnologies2100Bioanalyzer或其他等效产品。 3.DNAAdapter：详情请咨询华大智造或本公司。 4.其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TEBuffer（10mMTris-HCl，pH8.0-8.5+0.1mMEDTA）、低吸附EP管、PCR管、 磁力架、PCR仪等。 二、操作流程 图1OnePotIIDNA建库试剂盒操作流程 三、操作步骤 3.1DNA片段化/末端修复/dA尾添加（DNAFragment/EndPreparation/dA-Tailing） 该步骤将基因组DNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。 1.将表3中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。 2.于冰上配制表3反应体系。 InputDNA DNAFragment/EndRepair/dA-Tailing 4℃，1min；30℃，3-20min*；72℃，20min AdapterLigation 20℃，15min CleanUp/SizeSelection Beads-based，30min CleanUp/SizeSelection Beads-based，30minLibraryAmplification 3-16Cycles TargetCaptureorSequencingYeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第4页，共8页 表3DNA片段化/末端修复/dA尾添加PCR反应体系 名称体积（μL） InputDNAx Smearase®Mix10 ddH2OUpto60μL 3.使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。 4.将上述PCR管置于PCR仪，设置表4所示反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。 表4DNA片段化/末端修复/dA尾添加PCR反应程序 温度时间 热盖105°COn 4°C1min* 30°C3-20min** 72°C20min 4°CHold 【注】：*DNA片段化过程为有效控制片段化效果，避免过度酶切，反应程序可预先设置4°C，待模块温度降至4°C时，将PCR管放入PCR仪即可。 **对于完整的基因组DNA，酶切时间参考表5；对于质量不一的FFPEDNA样本，酶切时间参考表6。 表5常规基因组DNA片段化时间选择表表6FFPEDNA片段化时间选择表 插入片段主峰大小片段化时间优化范围 350bp8min5-12min 250bp10min8-15min 200bp13min10-20min 150bp20min12-25min 【注】：*DIN为DNAIntegrityNumber，是用Agilent2200来定义FFPEDNA降解程度的一种方法，详见图2。 图2Agilent2200定义不同降解程度样本的DIN值 3.2接头连接（AdapterLigation） 该步骤将3.1步骤的产物末端，连接特定的MGI®接头。 1.根据InputDNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。 2.将表7中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 3.于3.1步骤PCR管中配制表7所示反应体系。插入片段主峰大小片段化时间DIN* 250bp9-13min>8.0 250bp8-11min6.5-8.0 250bp4-8min4.2-6.5 250bp3-6min2.5-4.2YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第5页，共8页 表7AdapterLigationPCR体系 名称体积（μL） dA-tailedDNA（3.1步骤产物）60 LigationEnhancer30* FastT4DNALigase5 DNAAdapter5 【注】：*LigationEnhancer比较粘稠，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。 4.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 5.将PCR管置于PCR仪中，设置表8所示反应程序，进行接头连接反应。 表8AdapterLigationPCR反应程序 温度时间 热盖105°COff 20°C15min 4°CHold 【注】：当InputDNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。 3.3连接产物磁珠纯化（PostLigationCleanUp） 该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或AdapterDimer等无效产物。 3.3.1纯化操作步骤： 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取80μLHieffNGS®DNASelectionBeads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至AdapterLigation产物中，涡旋混匀或移液器吹 打10次混匀，室温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清。 6.重复步骤5，总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5min）。 8.将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱： 1）如产物无需进行片段分选，直接加入21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。【注： 如纯化产物如需保存，可使用TEBuffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5min），小 心移取20μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。 2）如产物需进行双轮分选，加入102μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5min。【注：如 纯化产物如需保存，可使用TEBuffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5min），小心 移取100μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。 3.3.2双轮分选操作步骤： 1.准备工作：将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出，室温平衡约30min。配制80%乙醇。 2.请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。 3.根据DNA片段长度要求，参考表9向上述100μLDNA上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。 表9磁珠文库分选推荐比例 DNA文库插入片段大小150-250bp200-300bp300-400bp DNA文库大小230-330bp280-380bp380-480bp 第一轮体积比（Beads:DNA）0.78×0.68×0.58× 第二轮体积比（Beads:DNA）0.20×0.20×0.20×YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第6页，共8页 【注】：表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为200bp，样品DNA体积为100μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.78×100μL=78μL； 第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100weishengL=20μL；表中所推荐比例是针对于AdapterLigatedInsertDNA（PostLigation），如果用户在接头连接 前进行分选，请采用HieffNGS®DNASelectionBeads（Cat#12601）说明书中推荐的比例。 4.室温孵育5min。 5.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5min），小心转移上清到干净的离心管中。 6.参考表7向上清中加入第二轮分选磁珠。 7.涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5min。 8.将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5min），小心移除上清。 9.保持PCR管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。 10.重复步骤9。 11.保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5min）。 12.将PCR管从磁力架中取出，加入适量21μLddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5min。 13.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5min），小心转移20μL上清至干净的管中。 3.4文库扩增（LibraryAmplification） 该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。 1.将表10中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。 2.于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。 表10PCR扩增反应体系 名称体积（μL） 2×UltimaHFAmplificationMix25 PrimerMixforMGI5 AdapterLigatedDNA（3.3步骤产物）20 3.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。 4.将PCR管置于PCR仪中，设置表11所示反应程序，进行PCR扩增。 表11PCR扩增反应程序 温度时间循环数 98°C1min1 98°C10sec 参照注意事项中表160°C30sec 72°C30sec 72°C5min1 4°CHold- 3.5扩增产物磁珠纯化或分选（PostAmplificationCleanUp/SizeSelection） 同3.3.1步骤中纯化操作步骤。使用HieffNGS®DNASelectionBeads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）纯化文库扩增产物。 如需分选，操作方法同3.3.2双轮分选步骤。 3.6文库质量控制 通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。 3.7文库环化 使用HieffNGS®Fast-PaceDNACyclizationKitforMGI®（Cat#13341）或其他等效产品进行文库单链环化反应。 YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第7页，共8页 3.8参考实例 使用HieffNGS®C130P2OnePotIIDNALibraryPrepKitforMGI®对小牛胸腺gDNA样本进行酶切建库检测，片段化结果见 图3；建库结果见图4。 图3OnePotIIDNA建库试剂盒酶切800ng小牛胸腺gDNA样本（不同酶切时间片段化效果检测） 图4使用本试剂盒进行humangDNA样本建库，文库进行电泳检测 （InputDNA为50ng，酶切12min，扩增8cycles） YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址：www.yeasen.com第8页，共8页 备忘录： ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ———————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————————
