告别克隆低效困境！精准限制酶让您的重组实验“切”半功倍！
限制性内切酶（又称限制酶），是一种能精准识别并切割双链 DNA 特定核苷酸序列的酶类。自 1965 年首次发现后，其精准性、稳定性持续升级，从早期天然酶到 2010 年高效工程酶的突破，推动了分子克隆从传统酶切连接迈向自动化精准组装。作为 “分子剪刀”，它可按实验设计定向切割目的基因与载体，为分子克隆、mRNA 质粒线性化等多领域应用奠定了基础。本文将解析其在主流克隆技术中的作用，并结合产品性能数据为实验选择提供参考。
图1. 限制性内切酶发展史[1]
分子克隆技术是分子生物学核心，其发展为生命科学带来革命性突破，支撑着基因克隆与表达、病毒包装与基因治疗、细胞治疗、蛋白质组学研究、基因敲除、药物筛选、农业育种等多领域发展。
近年来，分子克隆技术历经多轮迭代升级，形成了多元化技术体系：一步法克隆凭借 “快速便捷” 的显著优势成为主流选择；Gold Gate 克隆依托多酶切 - 连接的精准调控机制，成为复杂载体构建的首选方案；而传统的粘性末端 / 平末端克隆，因操作简便、成本可控的特性，至今仍是基础克隆实验中的重要手段。接下来，我们将逐一解析限制性内切酶在这三类主流克隆技术中的核心应用。
一步法克隆：快速重组的核心工具
-
原理：先通过限制性内切酶酶切或 PCR 制得线性化载体，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在同源重组酶（T5 Exonuclease 切割5’末端形成粘性末端，DNA聚合酶将15-25 bp的同源序列补齐，Taq DNA Ligase 连接缺口）的作用下，经过一定的时间和温度即可进行转化，完成定向克隆。
-
应用：依托限制性内切酶的特异性切割，适用于1-5片段快速重组，如目的基因克隆、质粒载体构建，广泛用于基因功能研究、蛋白质表达载体构建等基础科研。
图2. 一步法克隆技术原理图
Gold Gate 克隆：多片段组装的精准调控
-
原理：先通过 PCR 在目的片段两端引入 IIs 型限制性内切酶（如 BsaI、BsmBI）的识别序列，再用该酶特异性识别并切割目的片段与载体的酶切位点（切割位置在识别序列外侧），随后在连接酶作用下实现目的片段与载体的无缝连接（可单片段或多片段重组，优化条件下能组装超 20 个 DNA 片段），最后将重组产物转化涂板并鉴定阳性克隆。
-
应用：依托 IIs 型限制性内切酶的精准切割特性，适用于复杂载体构建场景，在多片段 DNA 组装、基因回路构建等分子克隆相关研究中发挥重要作用，满足科研中对多片段精准重组的需求。
图3. Gold Gate克隆技术原理图[3]
粘性末端 / 平末端克隆：基础克隆的经典高效方案
-
原理：先通过 PCR 扩增获得目的 DNA 片段，再用限制性内切酶分别切割目的片段与载体，使其产生互补的粘性末端（含单链突出区）或平末端（无突出区），随后在连接酶作用下将目的片段与载体连接形成重组载体，最后将连接产物转化至宿主细胞，经涂板培养与阳性克隆鉴定得到目标重组载体。
-
应用：依托限制性内切酶的特异性切割，因操作简便、成本可控，至今仍是基础克隆实验的重要手段，适用于基础科研中的常规目的基因克隆、简单载体构建等场景。
图4. 粘性末端 / 平末端克隆技术原理图
以上三种技术共同构成了当前分子克隆的核心方法体系，值得注意的是，以上三种克隆技术的高效运用，都离不开限制性内切酶的关键协助。作为中国分子酶领域的领军企业，翌圣生物成功攻克限制性内切酶的“卡脖子”难题，目前翌圣FuniCut®快速限制性内切酶已实现：
✅ 精准酶切：媲美进口品牌，且兼容其缓冲液，即使过夜酶切，星号活性也极低。
✅ 方便快速：5-15min快速酶切，通用缓冲液。
✅ 操作简便：提供红色Color缓冲液，酶切产物可直接点胶电泳。
✅ 供应链保障+成本双赢：国产化生产，摆脱断供风险。
性能展示
酶切效果媲美进口品牌，并且与其buffer兼容性好
图5. 翌圣FuniCut® BamHI酶切效果与进口品牌同类型产品相当，并且与N*、T*品牌的buffer兼容性好
在FuniCut® Buffer中，5 min完成单、双和三酶切
图6. 在通用的FuniCut® Buffer中，5 min可完成单、双和三酶切，如EcoRI+KpnI+SmaI三酶切
通过严格的对比数据，翌圣生物的限制性内切酶在酶切效果、酶切速度和星号活性等性能均能媲美国际品牌，且翌圣生物FuniCut®系列限制性内切酶兼容进口品牌buffer，可实现无缝替换。我们为您提供以下全系列产品清单，覆盖常规科研、诊断与工业化需求，助您无缝替换进口酶，无需改变实验流程，即可获得一致甚至更优的酶切效果。
常用限制性内切酶选择指南
|
产品货号 |
产品名称 |
酶活 (U/μL) |
规格 (T) |
识别序列 |
|
15003ES76 |
20 |
500T |
5'-G↓GATCC-3' |
|
|
15005ES50 |
20 |
50T |
5'-GGTCTC(N)1↓-3' |
|
|
15010ES78 |
20 |
600T |
5'-G↓AATTC-3' |
|
|
15012ES76 |
100 |
500T |
5'-A↓AGCTT-3' |
|
|
15015ES70 |
100 |
200T |
5'-GGTAC↓C-3' |
|
|
15018ES30 |
20 |
30T |
5'-C↓CATGG-3' |
|
|
15020ES30 |
20 |
30T |
5'-G↓CTAGC-3' |
|
|
15021ES50 |
20 |
50T |
5'-GC↓GGCCGC-3' |
|
|
15023ES60 |
20 |
100T |
5'-GAGCT↓C-3' |
|
|
15024ES70 |
20 |
200T |
5'-G↓TCGAC-3' |
|
|
15028ES50 |
20 |
50T |
5'-A↓CTAGT-3' |
|
|
15033ES76 |
20 |
500T |
5'-T↓CTAGA-3' |
|
|
15034ES76 |
20 |
500T |
5'-C↓TCGAG-3' |
|
|
15041ES25 |
10 |
25T |
5'-TTAAT↓TAA-3' |
|
|
15048ES30 |
10 |
30T |
5'-CGTCTC(N)1↓-3' |
|
|
15052ES50 |
20 |
50T |
5'-GAm6↓TC-3' |
|
|
15056ES25 |
20 |
25 T |
5'-A↓CCGGT-3' |
除以上常用限制性内切酶产品，翌圣现有超100种限制性内切酶，满足超90%常用需求。扫描下方二维码，即可获取翌圣限制性内切酶全系产品资料，文件包含：货号、产品名称、酶活、切割位点、buffer兼容活性等信息。
其他分子克隆相关产品推荐
|
产品类型 |
产品名称 |
货号 |
|
一步法克隆试剂盒 |
10923ES |
|
|
TOPO克隆试剂盒 |
10906ES |
|
|
PCR mix |
10167ES |
|
|
高保真酶 |
10166ES |
|
|
DNA连接酶 |
10300ES |
|
|
11051ES |
||
|
T5核酸外切酶 |
14538ES |
|
|
TOPO异构酶 |
14971ES |
|
|
感受态细胞 |
11803ES |
|
|
核酸染料 |
10202ES |
|
|
琼脂糖 |
10208ES |
|
|
DNA marker |
10501ES |
参考文献
[1] Di Felice F, Micheli G, Camilloni G. Restriction enzymes and their use in molecular biology: An overview[J]. Journal of biosciences, 2019, 44(2): 38.
[2] Johansson S. The use of Gibson Assembly for DNA cloning[J]. 2022.
[3] Biró J B, Kecskés K, Szegletes Z, et al. Golden EGG, a simplified Golden Gate cloning system to assemble multiple fragments[J]. Scientific Reports, 2024, 14(1): 25288.
