试剂盒内含两种荧光染料DMAO和EthD-III，可分别将活细菌和死细菌染上绿色和红色。其中DMAO是一种绿色核酸荧光染料，可染色活细菌和死细菌。EthD-III是一种红色核酸荧光染料，仅染色细胞膜受损的死细菌。将DMAO和EthD-III混合使用染色时具有完整细胞膜的细菌呈现绿色，而具有受损细胞膜的细菌呈现绿色和红色。结果可以通过荧光显微镜或流式细胞仪来分析，适用于大多数细菌类型。

细菌活力的常见标准是细菌在合适的营养培养基中繁殖的能力，称为生长测定。该试剂盒通常与在液体或固体培养基中的生长测定结果有着很好的一致性。在某些条件下，膜损伤的细菌可能会在营养培养基中恢复并繁殖，而这种细菌在该测定中可能会被认为死亡。相反，一些具有完整膜的细菌可能无法在营养培养基中繁殖，但这些细菌在该测定中可能被认为是活的。因此，如果发现该检测和细菌生长测定之间有相当大的差异，应该考虑上述的可能性。

光谱特性DMAO：Ex/Em=503/530nm（with DNA）； EthD-III：Ex/Em=530/620nm（with DNA）

准确性高，与在液体或固体培养基中的生长测定结果有着很好的一致性。

冰袋（wet ice）运输。储存于 4ºC，至少可以储存6个月。

Q1：菌悬液要怎么制备？

A：离心去除培养基，收集样本细菌，用 0.85% NaCl 溶液洗涤细胞 3 次（必须充分洗涤以去除培养基，残余的培养基会影响染色效果；不要用 PBS 等磷酸盐缓冲液洗涤，会影响染色效果）。 然后用 0.85% NaCl 溶液制备细胞悬液。

Q：说明书上写的是一个视野可以看到两种颜色，而我同一激发光为什么看不到两种颜色，分开激发就可以，为什么？

A： 有些显微镜是长通滤片，是可以观察到两种荧光；有的显微镜是短通滤片，不能同时观察到两种荧光的。若客户显微镜为短通道的滤片，建议客户分开激发和观察。

Q：两个染料受酯酶的影响吗？

A：不受

Q：说明书上写DMAO染色活细菌和死细菌于荧光显微镜或共聚焦显微镜下呈现绿色荧光，EthD-III染色膜受损的死细菌呈现红色荧光，那实际染色结果会是怎样的呢？

A：DMAO为膜透过性核酸染料可染色活细菌的DNA，其结合DNA的原理不能明确；EthD-III不具膜透过性仅可染色死细菌DNA，该染料为DNA插入型染料，具AT碱基偏好性（参考文献PMID:9016307）。在实际染色结果中会出现这样两种情况，且以下两种结果均为正常结果，原因是一方面染料结合DNA的情况，另一方面因细菌在染色液中的布朗运动：

1、红色荧光和绿色荧光出现共定位

在使用该试剂已发表的文献中参考PMID:  34161080，呈现红绿荧光共定位结果。

2、死细菌为红色荧光，活细菌及不健康细菌为绿色荧光，红色荧光和绿色荧光未呈现共定位。

Q：当用于染色细菌在共聚焦皿形成生物膜时，加入的染色液是否需要去除以及是否需要PBS buffer清洗？

A：染色液可以去除；可不进行PBS 清洗。

[1] Li X, Gui R, Li J, et al. Novel Multifunctional Silver Nanocomposite Serves as a Resistance-Reversal Agent to Synergistically Combat Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii. ACS Appl Mater Interfaces. 2021;13(26):30434-30457. doi:10.1021/acsami.1c10309(IF:9.229)

[2] Yang X, Jia M, Li Z, et al. In-situ synthesis silver nanoparticles in chitosan/Bletilla striata polysaccharide composited microneedles for infected and susceptible wound healing [published online ahead of print, 2022 Jun 23]. Int J Biol Macromol. 2022;215:550-559. doi:10.1016/j.ijbiomac.2022.06.131(IF:6.953)

[3] Wang Z, Ke M, He L, et al. Biocompatible and antibacterial soy protein isolate/quaternized chitosan composite sponges for acute upper gastrointestinal hemostasis. Regen Biomater. 2021;8(4):rbab034. Published 2021 Jun 30. doi:10.1093/rb/rbab034(IF:6.353)

[4] Xu M, Li J, Liu B, et al. The evaluation of long term performance of microbial fuel cell based Pb toxicity shock sensor. Chemosphere. 2021;270:129455. doi:10.1016/j.chemosphere.2020.129455(IF:5.778)

[5] Cao W, Zeng Z, He Z, Lei S. Hypoxic pancreatic stellate cell-derived exosomal mirnas promote proliferation and invasion of pancreatic cancer through the PTEN/AKT pathway. Aging (Albany NY). 2021;13(5):7120-7132. doi:10.18632/aging.202569(IF:5.682)

[6] Tang J, Wang W, Chu W. Antimicrobial and Anti-Quorum Sensing Activities of Phlorotannins From Seaweed (Hizikia fusiforme). Front Cell Infect Microbiol. 2020;10:586750. Published 2020 Oct 30. doi:10.3389/fcimb.2020.586750(IF:4.123)

[7] Yan Y, Zhou P, Lu H, et al. Potential apply of hydrogel-carried chlorhexidine and metronidazole in root canal disinfection. Dent Mater J. 2021;40(4):986-993. doi:10.4012/dmj.2020-299(IF:2.102)

[8] Cong S, Tong Q, Peng Q, et al. In vitro anti‑bacterial activity of diosgenin on Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia. Mol Med Rep. 2020;22(6):5392-5398. doi:10.3892/mmr.2020.11620(IF:2.100)