HieffNGS®C102P1UltimaDual-modemRNALibraryPrepKitforMGI®高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文 库构建试剂盒,本试剂盒将cDNA二链合成与Endprep、dA-tailing进行合并,极大地缩减建库时间。二链合成模块配有两 种Buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10ng-4μg不同来源真核生物总RNA 样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增,总RNA样品最终转化为 适用于华大平台测序的文库。 试剂盒包含两个独立模块,BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂,反转 录试剂,常规和链特异性dscDNA合成,以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为 dUTP,使cDNA第二链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异 性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。 产品组分 组分编号和名称13462ES0813462ES9613462ES97 BOX-I13484-AmRNACaptureBeads0.4mL4.8mL19.2mL 13484-BBeadsBindingBuffer0.5mL6mL24mL 13484-CBeadsWashBuffer5mL60mL240mL 13484-DTrisBuffer0.5mL6mL24mL BOX-II13462-AFrag/PrimeBuffer150μL2×900μL7.2mL 13462-B1stStrandEnzymeMix16μL192μL768μL 13462-CStrandSpecificityReagent50μL580μL2×1160μL 13462-D2ndStrandBuffer(dNTP)240μL2×1440μL12mL 13462-E2ndStrandBuffer(dUTP)240μL2×1440μL12mL 13462-F2ndStrandEnzymeMasterMix40μL480μL2×960μL 13462-GLigationEnhancer240μL2×1440μL12mL 13462-HNovelT4DNALigase40μL480μL2×960μL 13462-I2×SuperCanace®IIHigh-FidelityMix200μL2×1200μL9.6mL 13462-JEBBuffer1mL10mL40mL 13462-KPrimerMixforMGI44μL528μL2.1mL
冰袋运输。效期一年。存储温度如下,切不可搞错! BoxI:2-8℃保存;BoxII:-20℃保存。 注意事项 一、关于操作 1.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址:www.yeasen.com第2页,共10页2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。 3.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。 4.请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去 除RNA酶污染。 5.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测 区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的 DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。 6.本产品仅做科研用途! 二、应用范围 本试剂盒适用于起始模板量为10ng-4μg(体积≤50μL)的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓 度偏低,体积超过50μL,可使用HieffNGS®RNACleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent2100BioanalyzerRNA6000 Nano/Pico芯片检测,RIN值要求>7,以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。 本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo(dT)磁珠,只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的RNA, 如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外,FFPE样本中的mRNA降解严重,通常无完整的poly(A) 尾结构,故亦无法使用本试剂盒进行建库。 本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用,包括: 基因表达(geneexpression) 单核苷酸变异检测(singlenucleotidevariationdiscovery) 基因融合鉴定(genefusionidentification) 剪切变异体分析(splicevariantanalysis) 三、关于接头连接(AdapterLigation) 1.目前华大智造有2种序号的接头:1-128和501-596。关于其使用要求,请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨 询本公司。此外,华大智造申明:2种接头由于设计工艺不同,禁止混用,否则测序数据无法拆分! 2.我们建议选用高质量的商业化接头,如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的 防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。 3.建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5μL,请 根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TEbuffer,稀释过的接头可在4°C保存48小 时。 表1InputTotalRNA量与接头使用浓度推荐表 InputTotalRNAAdapterstockconcentration 100–499ng2μM 500–4000ng5μM *可根据不同类型TotalRNA样本及投入量,按需求适当调整Adapter使用量 四、关于磁珠纯化与分选(Bead-basedCleanUpandSizeSelection) 1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用HieffNGS®DNASelectionBeads(YeasenCat#12601)或 AMPure®XP磁珠(BeckmanCat#A63880)进行DNA纯化和分选。 2.磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。 3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。 4.转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址:www.yeasen.com第3页,共10页5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。 6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降 低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5min足以让磁珠充分干燥。 7.DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TEBuffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。 五、关于文库扩增(LibraryAmplification) 1.本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性, 即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。 2.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重 复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增,InputTotalRNA量与相 应扩增循环数的推荐。 表2InputTotalRNA量与扩增循环数推荐表* InputTotalRNANumberofcycles Non-strandedStranded 10ng1616 100ng1515 500ng1213 1μg1112 【注】:*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关,样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑, 选择最合适的建库条件。 六、自备材料(OtherMaterial) 1.mRNA富集试剂盒:HieffNGS®mRNAIsolationMasterKit(YeasenCat#12603)。 2.rRNA去除试剂盒:HieffNGS®MaxUprRNADepletionKit(Human/Mouse/Rat)(YeasenCat#12253)。 3.RNA纯化磁珠:HieffNGS®RNACleaner(YeasenCat#12602)或其他等效产品。 4.DNA纯化磁珠:HieffNGS®DNASelectionBeads(YeasenCat#12601)或AMPure®XPBeads(A63880)或其他等效产品。 5.RNA质控:Agilent2100BioanalyzerRNA6000Nano/PicoChip或其他等效产品。 6.Adapters:详情请咨询华大智造或本公司。 7.文库质检:Agilent2100BioanalyzerDNA1000Chip/HighSensitivityChip或其他等效产品;文库定量试剂。 8.其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。 使用方法 一、自备材料 1.纯化磁珠:HieffNGS®DNASelectionBeads(Cat#12601)或AMPureXPBeads(Cat#A63880)或其他等效产品。 2.RNA质控:Agilent2100BioanalyzerRNA6000Nano/PicoChip或其他等效产品。 3.Adapters:详情请咨询华大智造或本公司。 4.文库质检:Agilent2100BioanalyzerDNA1000Chip/HighSensitivityChip或其他等效产品;文库定量试剂。 5.其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。 YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址:www.yeasen.com第4页,共10页 二、操作流程 图1mRNA建库试剂盒操作流程 三、操作步骤 3.1mRNA纯化和片段化(mRNAPurificationandFragmentation) 1.将mRNACaptureBeads从2-8℃取出,静置使其温度平衡至室温,约30min。 2.准备一个Nucleasefree离心管,取10ng-4μg总RNA,用NucleaseFree水将体积补至50μL,冰上放置备用。 3.颠倒或旋涡振荡混匀磁珠,吸取50μL磁珠悬液加入至50μL总RNA样品中,用移液器吹打6次,使其充分混匀。 4.将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中,65℃,5min;25℃,5min;25℃,hold,完成RNA与捕获磁珠的结合。 5.将样品置于磁力架中,室温静置5min,使mRNA与总RNA分离,小心移除上清。 6.将样品从磁力架上取出,用200μLBeadsWashBuffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中, 室温静置5min,小心移除上清。 7.重复步骤6,共洗涤两次。 8.将样品从磁力架上取出,加入50μLTrisBuffer重悬磁珠,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。 9.将样品置于PCR仪中,80℃,2min;25℃,hold,将mRNA洗脱下来。 10.将样品从PCR仪中取出,加入50μLBeadsBindingBuffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。 11.室温放置5min,使mRNA结合到磁珠上。 12.将样品置于磁力架中,室温静置5min,小心移除上清。 13.将样品从磁力架上取出,用200μLBeadsWashBuffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以彻底混匀,将样品重新放回 至磁力架中,室温静置5min,吸掉全部上清。 【注】:最后需要用10μL移液器吸干净残留液体。 YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址:www.yeasen.com第5页,共10页14.将样品从磁力架上取出,用18.5μLFrag/PrimeBuffer重悬磁珠,用移液器吹打6次以彻底混匀;将样品置于PCR仪中 (预设为94℃),可参考表3选择片段化程序,但不同物种片段化的效果有差异,客户可先根据自己的情况,做个片段化 时间的梯度,比如94℃,5min。使用Agilent2100分析mRNA纯化产物大小。 表3mRNA片段化程序推荐 插入片段大小(bp)打断程序 200-30094°C,5min; 300-40085°C,8min; 400-50085°C,6min; 15.片段化程序结束后,为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合,请立即将样品置于磁力架中,待溶液澄清后,转移17μL上清 至一个新的NucleaseFree离心管中,立刻进入第一链合成反应(Part2-Step1)。 3.2第一链cDNA的合成: 1.将第一链合成试剂从-20°C取出,颠倒混匀后瞬离。按表4所示,配制第一链cDNA合成的反应液。 表4第一链cDNA合成反应体系 名称体积(μL) FragmentedmRNA17 StrandSpecificityReagent6 1stStrandEnzymeMix2 2.使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。 3.将上述PCR管置于PCR仪中,按照表5所示设置反应程序,进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA 的合成。 表5第一链cDNA合成反应程序 温度时间 热盖105°COn 25°C10min 42°C15min 70°C15min 4°CHold 3.3第二链cDNA的合成/末端修复/加A: 1.将第二链合成试剂从-20°C取出,解冻后颠倒混匀;按照表6所示,配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。 表6第二链cDNA合成反应体系 名称体积(μL) 1stStrandcDNA25μL 2ndStrandBuffer(dNTPordUTP)*30μL 2ndStrandEnzymeMasterMix5μL 【注】:*如构建普通mRNA文库,请使用含dNTP的buffer;如构建链特异性mRNA文库,请使用含dUTP的buffer。 2.使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。 3.将上述PCR管置于PCR仪中,按照表7所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。 表7第二链cDNA合成反应程序 温度时间 热盖105°Con 16°C30minYeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址:www.yeasen.com第6页,共10页72°C15min 4°CHold 3.4接头连接(AdapterLigation) 该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端,连接特定的MGI®接头。 1.参考注意事项三中的表1,根据InputRNA量,稀释Adapter至合适浓度。 2.将表8中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。 3.于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表8所示反应体系。 表8AdapterLigation体系 名称体积(μL) dA-tailedDNA60 LigationEnhancer30* NovelT4DNALigase5 DNAAdapter5** Total100 【注】:*LigationEnhancer使用前请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。 **本公司接头原始浓度为10μM,请根据注意事项二表1的提示,根据投入量对接头进行稀释,使接头添加体积固定为5μL。 4.使用移液器轻轻吹打混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。 5.将PCR管置于PCR仪中,设置表9所示反应程序,进行接头连接反应: 表9AdapterLigation反应程序 温度时间 热盖Off 20°C15min 4°CHold 3.5连接产物纯化(PostLigationCleanUp) 本方案适用于片段<200bp时,通过两次纯化去除体系中的接头残留;当插入片段≥200bp时,参照附录二的分选方案,通 过纯化、分选获得目标长度的文库。 适用于插入片段<200bp的文库(需进行两轮纯化) 1.准备工作:将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取60μLHieffNGS®DNASelectionBeads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至AdapterLigation产物中,涡旋或吹打混匀,室 温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5min),小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec后,小心移除上清。 6.重复步骤5,总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5min)。 8.将PCR管从磁力架中取出,加入52μLddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5min。将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3min),小心移取50μL上清至新PCR管中,再进行一轮纯化。 9.吸取40μLHieffNGS®DNASelectionBeads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至上一步产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5min。 10.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约3min),小心移除上清。 11.保持PCR管始终置于磁力架中,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec后,小心移除上清。 12.重复步骤11,总计漂洗两次。 13.保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5min)。 14.将PCR管从磁力架中取出,加入21μLddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5min。将PCRYeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址:www.yeasen.com第7页,共10页管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3min),小心移取20μL上清至新PCR管中,进行PCR扩增。 3.6文库扩增(LibraryAmplification) 该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。 该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。 1.将表10中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。 2.于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。 表10接头连接产物PCR反应体系 组分名称体积(μL) 2×SuperCanace®IIHigh-FidelityMix25 PrimerMixforMGI®5 AdapterLigatedDNA20 3.使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。 4.将PCR管置于PCR仪中,设置表11示反应程序,进行PCR扩增。 表11PCR扩增反应程序 温度时间循环数 98°C1min1 98°C10sec 11~16cycles*60°C30sec 72°C30sec 72°C5min1 4°CHold- *文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整,详见注意事项五。 3.7扩增产物磁珠纯化(PostAmplificationCleanUp) 1.准备工作:将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取45μLHieffNGS®DNASelectionBeads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至AdapterLigation产物中,涡旋或吹打混匀,室 温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5min),小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec后,小心移除上清。 6.重复步骤5,总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5min)。 8.将PCR管从磁力架中取出,加入21μLddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5min。将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3min),小心移取20μL上清至新PCR管中,进行文库定量、质检。 3.8文库质量控制 通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项五。 YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址:www.yeasen.com第8页,共10页附录一:mRNA片段化效果展示 图2.mRNA不同打断时间对应的RNA片段范围。分别以85°C,6min、85°C,8min和94℃,5min处理。打断后mRNA进行进行2.2X磁珠纯化, 通过Agilent2100Bioanalyzer进行检测。 【注】:本结果使用的RNA是Agilent公司的UniversalHumanReferenceRNA,若使用其他来源的RNA,最好优化打断时间。 附录二:分选条件说明 分选方案适用于85°C,6min、85°C,8min和94℃,5min片段化的RNA建库,可以获得插入片段大于200bp的文库: 方案一:接头连接产物纯化后分选 0.6XHieffNGS®DNASelectionBeads接头连接产物的纯化 1.准备工作:将HieffNGS®DNASelectionBeads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30min。配制80%乙醇。 2.涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。 3.吸取60μLHieffNGS®DNASelectionBeads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至AdapterLigation产物中,涡旋或吹打混匀,室 温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5min),小心移除上清。 5.保持PCR管始终置于磁力架中,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec后,小心移除上清。 6.重复步骤5,总计漂洗两次。 7.保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5min)。 8.将PCR管从磁力架中取出,加入102μLddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5min。将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5min),小心移取100μL上清至新PCR管中,准备进行双轮分选。 【注】:LigationEnhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响,所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。 双轮分选(以85°C,8min打断,分选文库大小为380bp~480bp为例说明,其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选) 1.请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。 2.根据DNA片段长度要求,参考表12,在上述100μLDNA中加入第一轮分选磁珠65μL(0.65×),涡旋或移液器吹打10 次混匀。 【注】:此表推荐的双轮分选比例适用于HieffNGS®DNASelectionBeads;表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300bp时,若 YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址:www.yeasen.com第9页,共10页在短接头连接之后分选,样品DNA体积为100μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100μL=65μL,第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100μL=15 μL。 3.室温孵育5min。 4.将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5min),小心转移上清到干净的离心管中,残留1-2μL溶液管 底。 5.参考表12向上清中加入第二轮分选磁珠15μL(0.15×)。 6.涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5min。 7.将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约3min),小心移除上清。 8.保持PCR管始终处于磁力架中,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec,小心移除上清。 9.重复步骤8。 10.保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约3min)。 11.将PCR管从磁力架中取出,加入21μLddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5min。 12.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约3min),小心转移20μL上清至干净管中。 表12接头文库分选推荐磁珠比例 插入片段长度(bp)200~300300~400400~500500~600 文库长度(bp)280~380380~480480~580580~680 打断条件94℃5min85℃8min85℃8min85℃6min 第一轮磁珠体积(ul)70(0.7×)65(0.65×)58(0.58×)50(0.5×) 第二轮磁珠体积(ul)20(0.2×)15(0.15×)15(0.15×)15(0.15×) 图3.1ug293totalRNA,在85°C,6min、85°C,8min和94℃,5min片段化后,根据表12推荐的磁珠比例得到的文库大小。 方案二:接头连接产物直接分选(以85°C,8min打断,分选文库大小为410bp~510bp为例说明,其他文库大小按推荐比 例进行磁珠分选) 500ng以上的总RNA做mRNA抓取后建库,推荐直接分选,体系比较粘稠,需要小心添加,RNA质量略差样本可能 会有接头残留。 1.请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。 2.根据DNA片段长度要求,参考表13,的连接体系中加入第一轮分选磁珠20μL(0.20×),涡旋或移液器吹打10次混匀。 室温孵育10min。 【注】:此表推荐的双轮分选比例适用于HieffNGS®DNASelectionBeads;表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300bp时,若 在短接头连接之后分选,样品DNA体积为100μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.20×100μL=20μL,第二轮分选磁珠使用体积为0.1×100μL=10μL。 3.将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5min),小心转移100μL上清到干净的离心管中,。 4.参考表13向上清中加入第二轮分选磁珠10μL(0.10×)。 5.涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置10min。 YeasenBiotechnology(Shanghai)Co.,Ltd. Hotline:400-6111-883 E-mail:order@yeasen.com 网址:www.yeasen.com第10页,共10页6.将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约3min),小心移除上清。 7.保持PCR管始终处于磁力架中,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30sec,小心移除上清。 8.重复步骤7。 9.保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约3min)。 10.将PCR管从磁力架中取出,加入21μLddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5min。 11.将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约3min),小心转移20μL上清至干净管中。 表13接头文库分选推荐磁珠比例 插入片段长度(bp)200~300300~400400~500500~600 文库长度(bp)280~380380~480480~580580~680 打断条件94℃5min85℃8min85℃8min85℃6min 第一轮磁珠体积(ul)25(0.25×)20(0.20×)15(0.15×)15(0.15×) 第二轮磁珠体积(ul)10(0.1×)10(0.1×)10(0.1×)10(0.1×) 备忘录: ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— ————————————————————————————————————— —————————————————————————————————————