iMeta! 翌圣 HiActi® 细胞因子助力筛选发现 mIDH1 共价抑制剂

文章标题：Construction of a clickable probe-based protein chip platform for discovering covalent mIDH1 inhibitors from natural medicinal extracts（IF=33.2）

期刊：iMeta

发表时间：2026年1月

研究团队：中国中医科学院医学实验中心杨洪军/陈鹏团队

研究结果：研究团队构建融合蛋白质微阵列与生物正交点击化学的Ccc-Chip共价分子筛选平台，并结合DSF预筛，从110种药用植物中发现Flavokawain C（Flc）。Flc可共价结合mIDH1的Cys269，抑制致癌代谢物2-HG生成，并通过恢复cGAS-STING信号、增强CD8+T细胞抗肿瘤活性抑制mIDH1驱动的肿瘤；与抗PD-1抗体联用进一步增强抗肿瘤作用。

全文逻辑主线：Ccc‑Chip平台构建优化→110种药用植物DSF初筛→Ccc‑Chip筛选得到候选提取物→锁定卡瓦胡椒提取物→HPLC分离得到活性馏分，经质谱‑共价虚拟对接鉴定Flc→生化细胞验证Flc共价结合mIDH1的Cys269，抑制2‑HG生成→体内证实Flc激活 cGAS‑STING、增强CD8+T细胞抗肿瘤免疫→与PD‑1抗体联用协同抑瘤。

一、实验背景

突变型异柠檬酸脱氢酶1（mIDH1）可获得异常酶活性，将α-酮戊二酸转化为致癌代谢物D-2-羟基戊二酸（2-HG），进而影响表观遗传调控并塑造免疫抑制性肿瘤微环境。尽管已有mIDH1抑制剂进入临床，但不同突变亚型覆盖、耐药及脱靶等问题仍推动新型抑制剂的发现。天然产物是共价药物的重要来源，但复杂植物提取物中共价活性分子的传统筛选往往受限于样品处理复杂和通量不足。

因此，本研究将蛋白质微阵列与生物正交点击化学整合为Ccc-Chip平台，并以DSF作为低成本预筛步骤，重点解决以下问题：

1. 能否建立一种可直接从复杂药用植物提取物中筛选半胱氨酸靶向共价分子的高通量方法？

1. 能否建立一种可直接从复杂药用植物提取物中筛选半胱氨酸靶向共价分子的高通量方法？

2. 能否利用该平台从大规模天然提取物中发现新的mIDH1共价抑制剂？

3. 筛得化合物是否真正与mIDH1形成共价结合，其关键结合位点是什么？

4. 抑制mIDH1后能否降低2-HG并进一步改善肿瘤免疫微环境？

二、主要实验方法与结果

（一）Ccc-Chip平台建立与条件优化

Ccc-Chip的核心原理是利用候选分子与半胱氨酸反应探针IAA-yne竞争靶蛋白上的反应位点。若候选分子预先占据靶蛋白反应性半胱氨酸，IAA-yne标记减少，随后通过Cu(I)催化的叠氮-炔点击反应连接TAMRA荧光基团后，芯片荧光信号相应下降。作者先在P50、AKT1和KRASG12C蛋白芯片上用已知共价配体验证原理，再构建包含IDH1-WT及R132H、R132C、R132G、R132S、R132L突变体的mIDH1蛋白芯片。

通过对IAA-yne浓度、点击反应体系和mIDH1蛋白浓度进行矩阵优化，最终确定较优筛选条件为：10 μM IAA-yne、1× click chemistry solution、0.3 μg/μL mIDH1蛋白；20 μM IAA可近乎完全竞争IAA-yne的蛋白标记，说明体系能够稳定检测半胱氨酸位点竞争占位。

图1. Ccc-Chip筛选原理、mIDH1蛋白芯片构建及反应条件优化（原文Figure 1）

（二）110种药用植物逐级筛选并锁定Piper methysticum提取物

作者首先对110种药用植物提取物进行DSF预筛，以|ΔTm|>1.5℃作为候选阈值，并对候选提取物进行多剂量DSF复筛。随后进入Ccc-Chip核心筛选，T30、T36、T56、T96和T110五种提取物可不同程度竞争IAA-yne与mIDH1结合。

进一步在TS603（IDH1-R132H）和HT1080（IDH1-R132C）细胞中检测2-HG，只有T96，即Piper methysticum Forst.提取物，在非明显细胞毒性浓度下呈剂量依赖性降低2-HG，因此被确定为后续活性成分分离对象。

图2. 从110种药用植物经DSF、Ccc-Chip和2-HG功能验证逐级筛选候选提取物（原文Figure 2）

（三）活性组分分离并发现Flavokawain C

Piper methysticum提取物经制备型HPLC分离为35个连续组分，再次通过DSF、Ccc-Chip和细胞2-HG检测进行逐层筛选。F19和F20在TS603和HT1080细胞中均可显著降低2-HG，因此合并进行质谱分析。作者随后以mIDH1的Cys269为反应位点开展共价虚拟对接，从候选分子中进一步锁定Flavokawain C（Flc）。

图3. Piper methysticum提取物的HPLC分级、Ccc‑Chip 复筛及活性组分F19/F20锁定（原文Figure 3）

（四）多维证据确认Flc共价结合mIDH1的Cys269

作者使用Ccc-Chip、CETSA、MALDI-TOF/TOF、LC-MS/MS、C269A位点突变和BLI构建了较完整的靶点结合证据链：Flc可竞争IAA-yne与mIDH1结合；提高IDH1-R132H热稳定性；使IDH1-R132H分子量增加；LC-MS/MS直接鉴定到Cys269修饰；Cys269突变为Ala后，Flc竞争结合及亲和力明显下降。

BLI结果显示，Flc与IDH1-R132H、IDH1-R132C的Kd分别约为0.516 μM和0.437 μM，而与IDH1-WT的Kd约为3.92 μM；C269A突变后Kd升至约133 μM，进一步支持Cys269是Flc的关键共价结合位点。细胞水平上，Flc可剂量依赖性降低mIDH1细胞中的2-HG，并降低H3K9me3、H3K9me2和H3K4me3等组蛋白甲基化水平。

图4. Flc-Cys269共价结合及mIDH1功能抑制的多维验证（原文Figure 4）

（五）Flc通过mIDH1-2-HG-cGAS-STING轴重塑抗肿瘤免疫

在TS603-R132H裸鼠移植瘤中，单次60 mg/kg Flc可使肿瘤内2-HG降低约67.1%，但连续给药并未显著抑制肿瘤生长。结合裸鼠缺乏成熟T细胞这一特征，作者进一步在免疫功能正常的C57BL/6小鼠中建立Hepa1-6-R132H原位肝癌模型。

在该免疫完整模型中，Flc降低肿瘤2-HG、抑制肿瘤生长并延长生存，同时恢复cGAS-STING-p-IRF3信号并提高CD8+ T细胞浸润。scRNA-seq与流式结果显示，Flc增加CD8+细胞毒性T细胞、降低CD8+耗竭T细胞，提高IFN-γ+ CD8+ T细胞并降低PD-1+ CD8+ T细胞比例。进一步使用anti-CD8α抗体耗竭CD8+ T细胞后，Flc的抑瘤作用明显减弱，说明其抗肿瘤效应至少部分依赖CD8+ T细胞。Flc与抗PD-1抗体联合处理表现出更强的肿瘤抑制作用，提示mIDH1代谢干预与免疫检查点阻断具有联合治疗潜力。

图5. CD8+ T细胞功能验证、CD8耗竭救援实验及Flc联合抗PD-1治疗（原文Figure 6）

三、翌圣生物产品在本研究中的应用

（一）细胞培养质量控制：PCR支原体检测

本研究所使用TS603、Hepa1‑6‑Luc、BV2、HEK293T、HT1080、ADSC、HUVEC等细胞均开展完整细胞质量控制，定期采用翌圣生物PCR 支原体检测试剂盒（40614ES）开展支原体PCR检测，规避支原体污染对蛋白筛选、代谢物检测及免疫功能相关实验带来的干扰。

（二）CD8+ T细胞分选、激活扩增及肿瘤杀伤验证

取6–8周龄雄性C57BL/6小鼠，无菌分离脾脏，将脾脏置于预冷PBS（41403ES）中，经70 μm细胞筛（84702ES）研磨制备单细胞悬液，300×g 离心5 min沉淀采用红细胞裂解液（40401ES）室温裂解5 min，加入预冷PBS终止裂解，洗涤2次，获得脾细胞悬液。使用翌圣Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit（37661ES）富集CD8+ T 细胞。富集得到的CD8+ T细胞重悬于完全RPMI‑1640培养基，添加翌圣Recombinant Mouse IL‑2（90142ES）与CD3/CD28抗体偶联磁珠（37633ES）（磁珠：细胞=1:1），培养7天完成活化扩增（每2天半量换液并补加IL‑2至终浓度500 U/mL）得到活化CD8+效应T细胞。这些CD8+效应T细胞随后用于Hepa1-6肿瘤细胞共培养杀伤实验，作为功能性证据验证Flc处理后肿瘤细胞环境可增强CD8+ T细胞介导的抗肿瘤效应。

四、Yeasen HiActi® Recombinant Mouse IL-2 Protein 重组小鼠白介素-2 产品特点

▍翌圣生物依托多年研发生产经验与技术积累，开发了一系列“三高一低”的HiActi®细胞因子，经过严格的质量控制及细胞功能的验证，确保产品具有高活性、高纯度、高稳定性、低内毒素水平，助您拿到理想的实验结果。

图6. Mouse IL-2 Protein on SDS-PAGE under reduced condition. The purity is greater than 95%.

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产品类别	产品货号	产品名称
重组蛋白类	90142ES	HiActi® Recombinant Mouse IL-2 Protein 重组小鼠白介素-2
细胞类	41401ES	高糖培养基（含L-谷氨酰胺，丙酮酸钠110mg/L；不含HEPES，双抗）
	41402ES	RPMI1640培养基（含L-谷氨酰胺；不含丙酮酸钠，HEPES，双抗）
	44505ES	CelCulSF™ 间充质干细胞无血清扩增培养基Plus
	41405ES	Hieff® 减血清培养基(转染专用，含酚红)
	40132ES	胎牛血清（特级）
	41403ES	1× PBS，细胞培养级
抗体类	38513ES	IDH1 Mouse mAb
	773178ES	Histone H3 (10A10) Mouse mAb
	31098ES	cGAS Rabbit pAb
	772964ES	STING Rabbit mAb
	32121ES	Purified Mouse Anti-Human CD8a mAb
小分子类	712927ES	Flavokawain C 卡瓦胡椒素C
	55391ES	AG-120
	724057ES	Olutasidenib
	53173ES	Scutellarin
	703259ES	Apigenin-7-glucuronide

细胞因子选购指南

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