1、疾病生物标志物发现

circRNA因其高稳定性、组织特异性和在体液中的可检测性，成为理想的疾病生物标志物。在脓毒症患者外周血单个核细胞（PBMC）的研究中，通过总RNA测序鉴定出circRNA转录组，发现circASPH的两个异构体（circASPH(2,3,4)和circASPH(2,4)）在ICU入院时高表达，其中circASPH(2,3,4)的水平与住院时长呈正相关，可作为疾病严重程度的指示指标。内皮细胞特异性的circCARD6/circPLXNA2特征可准确区分血管亚型，指导抗血管生成治疗。外泌体中的circANRIL因其卓越的稳定性，为冠状动脉疾病的无创诊断提供了新工具。

2、癌症分子分型与机制研究

circRNA在多种肿瘤中异常表达，参与肿瘤发生发展的多个环节。国家生物信息中心与中国科学院动物研究所合作，对涵盖30种癌症类型的2,535个人类癌症及正常样本转录组测序数据进行整合挖掘，构建了迄今规模最大的AI-ready肿瘤相关circRNA数据资源CIRIonco。基于差异剪接的circRNA构建的组织类型溯源与疾病表型预测模型，实现了样本来源器官系统、组织类型及疾病水平的精准预测。

3、免疫治疗响应预测与耐药监测

circRNA在肿瘤免疫微环境中发挥双重作用：部分 circRNA 通过稳定PD-L1、诱导免疫抑制性细胞聚集促进免疫逃逸；另一些则激活RIG-I/MAVS或STING通路，增强抗肿瘤免疫。外泌体circUSP7和circ0001947分别与非小细胞肺癌和胃癌的PD-1耐药相关，可作为免疫治疗监测标志物。

4、circRNA疫苗与治疗性RNA开发

circRNA的稳定性、低免疫原性和持续蛋白表达能力，使其成为mRNA疫苗的升级替代品。2024年研究显示，circRNA疫苗在动物模型中诱导更强的免疫反应和更持久的抗原表达，且无需核苷修饰即可抵抗先天免疫识别。NGS技术用于 circRNA 环化效率评估、序列验证和纯度检测，是生产工艺质控的关键。

1、样本采集与RNA提取

组织样本：新鲜组织液氮速冻，-80℃保存；或RNAlater稳定保存；体液样本：血浆、血清、尿液采集后即刻分离，-80℃保存，避免反复冻融。

RNA提取采用专用试剂盒，全程无RNase操作。circRNA建库需要较大Input量，需提前评估样本量是否充足。质控：Qubit精确定量RNA浓度；Bioanalyzer评估RNA完整性（RIN值）；琼脂糖凝胶电泳检测28S/18S比例。

2、文库构建

RNase R预处理方案：在文库构建前，采用RNase R消化线性RNA，富集circRNA。

核糖体RNA去除：采用商业化试剂盒去除rRNA，保留包括circRNA在内的全部转录本。

反转录：随机引物反转录合成cDNA第一链。第二链合成与文库制备：合成第二链cDNA，末端修复、加A尾、连接测序接头。PCR扩增：引入样本特异性Index序列，富集文库。磁珠纯化：去除引物二聚体和非特异性产物。

测序：数据量建议6 Gb/样本以上。

3、生物信息分析

常用分析工具：比对工具比较：研究评估了TopHat、STAR、MapSplice、BBduk四种比对工具，MapSplice准确性最高，TopHat灵敏度最高。识别工具：CIRI2/CIRI3、find_circ、CIRCexplorer、DCC、KNIFE等。CIRI3是面向TB级数据的最新工具，可高灵敏识别低丰度及非传统剪接信号的新型circRNA。

核心分析流程：数据质控：FastQC评估，cutadapt去除接头和低质量序列。核糖体RNA过滤：比对至rRNA数据库去除rRNA序列。基因组比对：hisat2/CIRI2或STAR等工具将有效reads比对至参考基因组。circRNA识别：基于反向剪接位点特征识别circRNA，CIRIquant等工具可整合多种算法。表达定量：计算反向剪接位点读段数（BSJ reads），标准化为BSJ ratio或RPM。CIRI3计算的剪接比率在不同批次样本间表现出高度稳健性。mRNA表达分析：将mapping reads通过string组装成mRNA，获得mRNA表达矩阵，用于circRNA剪切比率计算。

高级分析：差异表达分析：edgeR/DESeq2筛选组间显著差异circRNA。功能预测：预测circRNA结合的miRNA（TargetScan、miRanda）和RNA结合蛋白。ceRNA网络构建：整合circRNA-miRNA-mRNA互作对，构建调控网络。异构体分析：识别同一基因座产生的多种circRNA异构体。机器学习建模：基于差异circRNA构建诊断/预后预测模型。