iPSC神经分化全攻略:从神经干/祖细胞诱导到神经元、胶质细胞培养与鉴定
iPSC神经分化全攻略:从神经干/祖细胞诱导到神经元、胶质细胞培养与鉴定
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2026-10-30
本文整理了从人iPSC诱导生成NSCs/NPCs,到神经干/祖细胞扩增、冻存及向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞定向分化的实验流程,并结合不同分化阶段的细胞形态观察、培养条件及免疫荧光标志物鉴定,为神经分化相关研究提供参考。
iPSC培养基:
400 mL DMEM/F12(41406ES)+5 mL 100× MEM非必需氨基酸溶液(60707ES)+5 mL 200 mM L谷氨酰胺(60757ES)+100 mL 血清替代物SR+ 500 μL 0.1 M β巯基乙醇(52644ES)/DTT二硫苏糖醇(20311ES)+200 μL 10 μg/mL bFGF(91330ES)(由41412ES 0.1%BSAPBS配制)试剂配制后,请避光2~8 ℃保存,有效期2周。
注:
1. 建议用DTT二硫苏糖醇(20311ES)代替β巯基乙醇。DTT 二硫苏糖醇作用与β-巯基乙醇相似,但DTT的刺激性和毒性都低于β-巯基乙醇,且粉末的稳定性也高于β-巯基乙醇。
2. 2-巯基乙醇-d6(52644ES)是2-巯基乙醇的氘代形式。
1. 实验前,生物安全柜内部紫外照射消毒1 h,并用70%乙醇擦拭将在安全柜内使用的工具和用品。
2. 使用状态优良、无分化集落的人iPSC细胞培养于丝裂霉素C(53380ES)处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上,使用iPSC培养基,培养于100 mm培养皿(84003ES)。iPSC汇合度70‑80%时,每37天传代一次。
注:
a. 若显微镜下观察到iPSC集落出现分化区域,在生物安全柜内倒置显微镜下,使用玻璃巴氏吸管或200 μL枪头(83061ES)刮除分化部分。
b. iPSC细胞质量直接决定神经诱导成功率,故建议对多个iPSC细胞株测试神经分化能力。
3. 6孔板每孔加入1 mL Ceturegel® Matrix hESC-Qualified,LDEV-Free 基质胶(40190ES)包被,置于37 ℃、5%CO₂培养箱,至少孵育1 h。
4. iPSC汇合度达到70‑80%时,胶原酶IV(40510ES)消化收集iPSC:吸弃旧iPSC培养基,5 mL PBS(41403ES)清洗一次,每皿加入4 mL胶原酶IV溶液。
5. 37 ℃、5%CO₂培养箱孵育30 min。
注:可视情况延长10‑15 min,总消化时间不可超过60 min,避免细胞活性下降。
6. 观察细胞集落边缘开始翘起,去除胶原酶IV,加入10 mL iPSC培养基稀释并洗去残留胶原酶IV。
7. 使用10 mL移液管轻柔吹打,收集iPSC转移入15 mL离心管。
8. 静置离心管10 min,依靠重力沉降去除MEF饲养层细胞。iPSC集落沉降管底,MEF为单细胞悬浮在上清。小心吸弃含MEF的上清,不要扰动底部iPSC沉淀。
9. 加入6 mL iPSC培养基重悬细胞,取部分样本测定细胞浓度:
a. 吸取1 mL细胞悬液至新15 mL离心管;
b. 200 × g离心3 min,弃上清;
c. 加入1 mL Accutase(40506ES),37 ℃孵育5 min,将iPSC团块解离为单细胞;
d. 吹打混匀,台盼蓝染色(40207ES)计数。
10. 吸弃步骤3中6孔板的Ceturegel® Matrix hESC-Qualified,LDEV-Free 基质胶(40190ES),每孔加入2.5 mL iPSC培养基。
11. 轻轻震荡装有iPSC悬液的离心管,将细胞接种到6孔板,接种密度2.5×10⁵‑3×10⁵细胞/孔。
注:本方案需要iPSC以细胞团块形式接种,单细胞接种无法存活。
12. 孔内加入ROCK抑制剂Y2763(52604ES),终浓度10 μM。
13. 前后、左右轻柔晃动培养板使细胞分布均匀,禁止画圈涡旋晃动,否则细胞团分布不均。
14. 放入37 ℃、5%CO₂培养箱,过夜培养。

图1. 人iPSC经NSCs/NPCs向神经元分化的神经诱导示意图
神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)筛选培养基:
DMEM/F-12(41406ES)+0.5% N2(60706ES)+1 mM L谷氨酰胺(60757ES)+1% MEM非必需氨基酸溶液(60707ES)+ 0.1 mM β巯基乙醇(52644ES)+0.5%细胞培养用青霉素-链霉素(60162ES)
神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基:
DMEM/F-12+0.5% N2+1 mM L谷氨酰胺+1% MEM非必需氨基酸溶液+ 0.1 mM β巯基乙醇+0.5%细胞培养用青霉素-链霉素+bFGF(91330ES)
Neurobasal完全培养基:
神经元基础培养基(41410ES)+2% B-27(60703ES)+10 ng/mL BDNF(92129ES)+0.5%细胞培养用青霉素-链霉素
1)从iPSCs诱导获得NSCs/eNPCs
1. 6孔板每孔加入2 mL 1× PBS(41403ES),在室温下清洗2次
2. 6孔板每孔加入2 mL预热的神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)筛选培养基培养,并每隔一天更换一次培养基。
3. 在培养第5天,将神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)筛选培养基更换为神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基,继续培养7天。
4. 在使用神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基培养3–5天后,约50%–70%的细胞克隆中会出现细胞聚集体。注:如果培养7天后,形成的神经样结构仍然较少,则可继续培养5–7天。这些细胞聚集体表达神经干细胞相关标志物,包括NESTIN、SOX1和MUSASHI(相应抗体选择指南见后文)

图2. 在神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基中培养并进行分化的iPSCs,可观察到逐渐发育形成神经玫瑰花环结构(neural rosettes)的细胞聚集体中表达神经干细胞标志物。
2)神经球样结构的形成
1. 吸去原有培养基,使用1 mL DMEM/F12培养基清洗细胞两次,然后加入2 mL预热的神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基
2. 将培养板放置于显微镜下,使用4×物镜观察。使用弯曲的20G针头,将细胞聚集体切割成直径约40–50 μm的小块
3. 收集含有切割后细胞聚集体的神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基,将其转移至超低吸附6孔板中,放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养。
4. 第2天,细胞聚集体应逐渐变圆,形成悬浮的球形细胞聚集体,这些结构称为神经球样结构(NLSs),见图3a。

图3. 神经球样结构(NLSs)和神经玫瑰花环结构(Neural rosettes)的形成。
a. 由细胞聚集体形成的神经球样结构(NLSs),这些结构可进一步发育形成神经玫瑰花环;b. 将细胞聚集体解离为单细胞悬液后,利用培养板形成的神经球样结构(NLSs);c. 将纯化后的神经球样结构(NLSs)接种培养12小时后,观察到的神经玫瑰花环结构的显微照片。比例尺:50 μm。
5. 使用神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基继续培养 NLSs,培养时间为2–3天。每天按照以下步骤更换一半培养基:
a. 收集培养板中悬浮的 NLSs,将其转移至15 mL锥形离心管(83505ES)中。
b. 静置10分钟,使NLSs沉降至离心管底部。
c. 将一半原培养基更换为新鲜培养基。
d. 将NLSs转移回超低吸附6孔板中。
e. 为使NLSs在培养孔中均匀分布,使用5 mL移液管上下吹打3–4次,将其重新悬浮。
注:由于NLSs容易迅速沉降至容器底部,因此每次只向两个培养孔中分装细胞悬液,并在每次分装前重新悬浮。
6. 继续培养,直至NLSs的直径达到约300 μm。
3)神经球样结构的纯化
1. 将悬浮于神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基中的NLSs转移至15 mL锥形离心管中,静置10分钟,使其沉降。
2. 吸去上清液,使用12 mL神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基重悬NLSs。
3. 将 NLSs 悬液分装至Ceturegel® Matrix hESC-Qualified,LDEV-Free 基质胶(40190ES)包被的6孔板中,每孔加入2 mL,过夜培养后,NLSs通常会贴附于培养板底部,并逐渐展平。此时可以观察到神经玫瑰花环结构(neural rosettes),见原文图3c。
4. 按照步骤2)1-3切割并收集神经玫瑰花环结构后培养。
5. 第2天,神经玫瑰花环结构应再次变圆,形成NLSs。继续培养2–3天,直至其直径达到约300 μm。按照步骤2)5.a-e中描述的方法,每隔一天更换一半培养基。
4) 建立NSCs/eNPCs单层培养体系
1. 收集 NLSs,并使用神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基将其转移至Ceturegel®基质胶包被的6孔板中培养。
2. 数小时后,NLSs会贴附于培养板表面,神经干细胞(NSCs)开始从NLSs中向外迁移。
此时将形成一种异质性细胞培养体系,其中包含 NSCs 和早期神经祖细胞(eNPCs)。在这一阶段,培养物中仍可能观察到成纤维细胞样细胞,应在倒置显微镜下,使用移液器吸头刮除这些细胞。
5) NSCs/eNPCs的传代
1. 吸去神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基,并使用DMEM/F12培养基清洗细胞。
对于6孔板培养体系,每孔加入Accutase,于37°C孵育3分钟。随后加入2 mL DMEM/F12培养基,用移液器吸头轻柔地反复吹打,使细胞脱离培养板。
2. 将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中,1,200 rpm离心5分钟后弃去上清液。
3. 使用12 mL神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基重悬细胞。随后将细胞接种至适当的Ceturegel® 基质胶包被培养板中继续培养。
4. 第2天,将神经干/祖细胞(NSCs/NPCs)扩增培养基更换为CelCulSF™ TeSR多能干细胞培养基(44501ES)继续培养细胞,直至细胞达到汇合状态,见图4b。

图4. iPSC来源NSCs/eNPC的免疫细胞化学分析。比例尺:50 μm。
当细胞达到汇合状态时,6孔板每孔约含有:3×10⁶个细胞。从这一阶段开始,NSCs/eNPCs CelCulSF™ TeSR多能干细胞培养基(44501ES)进行维持培养和传代。
注:为了降低发生染色体异常的风险,不建议将NSCs/NPCs 连续扩增超过12代。
6) NSCs/eNPCs冻存与复苏
方法
1. 吸去培养基,使用DMEM/F12培养基清洗细胞。
2. 对于6孔板培养体系,每孔加入 1 mL Accutase,于37°C孵育3分钟。
3. 加入2 mL DMEM/F12培养基,使用移液器吸头轻柔地反复吹打,使细胞脱离培养板。
4. 使用台盼蓝染色法(40207ES)计数活细胞。
5. 将细胞以1200 rpm离心5分钟,使细胞沉淀。
6. 弃去上清液,通过轻弹离心管使细胞沉淀松散。
7. 使用无血清细胞冻存液(40153ES)重悬细胞,将细胞浓度调整至4×106 cells/mL。
8. 将细胞悬液按每管500 μL分装至冻存管(84105ES)中,放入细胞程序降温冻存盒(84608ES),并立即转移至−80°C冰箱。
9. 第二天,将冻存管转移至−135°C超低温冰箱或液氮储存容器中长期保存。
复苏
1. 从低温储存设备中取出一支冻存管,使用 70%乙醇喷洒冻存管外表面进行消毒。
2. 向15 mL锥形离心管中加入5 mL预冷的 DMEM/F12培养基。
3. 打开冻存管盖,使用1 mL或5 mL移液管从上方向冻存的细胞悬液施加压力,使冻结的细胞块松动或破裂,这种操作可以使冻存细胞迅速转移至培养基中,从而提高细胞回收率。
4. 向冻存管中加入500 μL预冷的DMEM/F12培养基,将管内全部内容物转移至上述15 mL锥形离心管中。
5. 以1200 rpm离心5分钟。
6. 弃去上清液,使用2 mL DMEM/F12培养基清洗细胞。
7. 使用8 mL CelCulSF™ TeSR多能干细胞培养基培养基重悬细胞。
8. 将细胞悬液接种至Ceturegel®基质胶包被的6孔板中,每孔加入2 mL细胞悬液。
9. 继续培养细胞,直至达到汇合状态。培养期间每隔一天更换一次培养基。
1. 按照前文所述的方法,使用Accutase消化神经干细胞/早期神经祖细胞(NSCs/eNPCs)使细胞解离。
2. 对细胞进行计数,并使用适量的CelCulSF™ TeSR多能干细胞培养基重悬细胞。
3. 按照以下密度将细胞接种至培养板中:
96孔板:每孔接种1×104个细胞(10000 cells/well)
384孔板:每孔接种2.5×103个细胞(2500 cells/well)
4. 接种后的第二天,将CelCulSF™ TeSR多能干细胞培养基更换为Neurobasal完全培养基,并继续培养4周。
5. 在培养过程中,每隔一天吸去一半原培养基,并补充等体积的新鲜培养基。
6. 在上述培养条件下,可以获得神经元高度富集的细胞培养物图5。

图5. iPSC来源神经元的免疫染色分析
a. TUJ1:神经元标志物(βIII-微管蛋白)b. MAP2:微管相关蛋白2 c. VGLUT1:囊泡谷氨酸转运蛋白1 d. NR1:N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)的NR1亚基
星形胶质细胞分化培养基:
DMEM(41401ES)+ 2 mM Glutamax(60701ES)+1% N-2(60706ES)+1% 青霉素-链霉素(60162ES)、1%胎牛血清(40132ES)+20 ng/ml CNTF(92123ES)。
1. Ceturegel® Matrix hESC-Qualified,LDEV-Free 基质胶(40190ES)基质胶融化后,用预冷的枪头混匀。
2. 采用无血清培养基稀释Ceturegel®基质胶到需要的浓度。建议根据具体的实验做个梯度实验,从而确定最佳的包被浓度。
3. 将稀释的Ceturegel®基质胶加入需要包被的培养器皿中,包被量至少覆盖细胞的所有生长表面。室温下孵育1小时。
4. 去除未凝固结合的Ceturegel®基质胶,用无血清培养基轻轻地冲洗。此时平板即可使用。
5. 神经干细胞接种包被于Ceturegel®基质胶的培养板,铺板浓度为2.5×104个细胞/cm2。
6. 培养2天后,将培养基更换为星形胶质细胞分化培养基。细胞分化培养周期为3–12周,分化期间传代3–5次,每3–4天更换一次培养基。
7. 3周后,成熟神经元可以开展免疫荧光染色检测(见后文)。
含维生素A的神经维持培养基(NMM):
482 mL DMEM/F12(41406ES)+482 mL Neuronal-Basal Medium(41410ES)+10 mL 含维生素A的B27(60503ES)+5 μg/mL Insulin(92366ES)+5 mL Glutamax(60701ES)+5 mL N2 supplement(60706ES)+5 mL NEAA(60707ES)+10 mL Penicillin-Streptomycin(60162ES)+10 μM β-mercaptoethanol
不含维生素A的神经维持培养基(NMM):
482 mL DMEM/F12+482 mL Neuronal-Basal Medium+10 mL 不含维生素A的B27(60704ES)+5 μg/mL Insulin+5 mL Glutamax+5 mL N2 supplement+5 mL NEAA+10 mL Penicillin-Strep tomycin+10 μM β-mercaptoethanol
1. 将hiPSC接种到6孔板(84011ES)。每孔3 mL预温含维生素A培养基NMM+20 ng/mL EGF(92708ES)+4 ng/mL bFGF(91330ES)+10 μM Y27632(52604ES)+20n g/mL T3(54574ES),用于形成胚状体(EB)。建议2孔iPSC对应1孔EB。
2. 次日(第1天)更换2/3培养基:轻轻旋转使细胞聚集到孔中央,小心吸除2 mL,再补加2mL同配方预温培养基。
3. 第2天更换2/3培养基,使用含维生素A培养基NMM+20 ng/mL EGF(92708ES)+4 ng/mL bFGF(91330ES)+10 μM Retinoic acid(53001ES)。
4. 之后隔日重复换液。
5. 第10天将EB接种到Ceturegel®基质胶包被板。若EB颜色很深或密度下降,可提前接种,但不早于第4天,通常第8天较理想。
6. 第10天,将全部培养基更换为预温含维生素A培养基NMM+20 ng/mL EGF(92708ES)+20 ng/mL T3(54574ES)。
7. 之后隔日更换2/3培养基;细胞达到90%密度时,使用Accutase(40506ES)传代到新的Ceturegel®基质胶包被板。
8. 第18天,更换为不含维生素A培养基NMM+20 ng/mL EGF(92708ES),继续按上一步方式换液与传代。
9. 第37天,更换为不含维生素A培养基NMM+5 ng/mL bFGF(91330ES)+5 ng/mL EGF(92708ES)+1 μg/mL Mouse Laminin(92364ES)+50 μg/mL L-Ascorbic acid(60374ES),继续换液/传代。
10. 第39天,更换为不含维生素A培养基NMM+5 ng/mL bFGF(91330ES)+5 ng/mL EGF(92708ES)+1 μg/mL Mouse Laminin(92364ES)+50 μg/mLL-Ascorbic acid(60374ES)+50 ng/mL Noggin(92623ES),继续换液/传代。
11. 第42天,更换为不含维生素A培养基NMM+1 μg/mL Mouse Laminin(92364ES)+50 μg/mL L-Ascorbic acid(60374ES)+50 ng/mL Noggin(92623ES),继续换液/传代。
12. 将OPC在第11步培养基中继续培养至第65天。
注:
1. EB接种:收集含EB的培养液至15或50mL管(83505ES/83507ES),静置2-3min使EB沉降,吸去大部分培养液并用目标培养基重悬。12孔板(84012ES)每孔1 mL,6孔板(84011ES)每孔2 mL。第4-9天接种时使用含维生素A培养基NMM+20 ng/mL EGF(92708ES)+4ng/mL bFGF(91330ES)+10 μM Retinoic Acid (53001ES)+20 ng/mL T3。若第10天接种,则使用含维生素ANMM+20 ng/mL EGF(92708ES)+20 ng/mL T3。
2. 传代后在培养基中加入Y27632有助于细胞恢复。
1. 小心吸弃上清培养基。
注:吸弃、添加缓冲液动作必须轻柔,防止细胞脱落。
2. 加入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液室温固定细胞15 min。
3. 吸去多聚甲醛溶液后,用PBS清洗细胞3次。
4. 室温下用PBS配制的0.1% Triton X-100透化细胞10 min。
5. 吸去透化液后,用PBS配制的5% BSA在室温封闭60 min。
6. 吸去封闭液后,将一抗用封闭液稀释,4 °C孵育过夜。
一抗选择指南
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细胞名称 |
抗原 |
产品货号 |
产品名称 |
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神经干/祖细胞 |
SOX1 |
SOX1 Rabbit mAb |
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NESTIN |
Nestin Rabbit mAb |
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PAX6 |
PAX6 Rabbit mAb |
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神经元 |
TUJ1 |
beta III Tubulin Rabbit mAb |
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NR1 |
Phospho-NMDAR1 (Ser890) Rabbit pAb |
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VGluT1 |
VGluT1 Rabbit mAb |
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MAP2 |
MAP2 (3B5) Mouse mAb |
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Dcx |
Doublecortin Mouse mAb |
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少突胶质细胞 |
GalC |
GALC Rabbit pAb |
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Olig2 |
Olig2 Mouse mAb |
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MBP |
MBP Rabbit pAb |
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星形胶质细胞 |
GFAP |
GFAP Rabbit mAb |
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S100B |
S100B Rabbit pAb |
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EAAT1 |
EAAT1 Rabbit mAb |
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EAAT2 |
EAAT2 Rabbit mAb |
注:OLIG2和MBP不能标记所有人少突胶质细胞谱系细胞
神经干细胞抗体选择指南详情见官网:神经干细胞(NSCs)应用抗体推荐
7. 吸弃一抗,PBS洗涤3次,去除未结合一抗。
8. 加入对应荧光二抗(PBS稀释),室温避光孵育60 min。
二抗选择指南详情见官网:如何选择合适的二抗
9. 弃二抗,PBS洗3次;最后一次洗涤可加入DAPI溶液(3 ng/mL)/Hoechst33258(1 μg/mL)复染细胞5-10分钟,再使用PBS冲洗。如需要,每张玻片可以滴加Fluoromount-GTM 抗荧光淬灭封片剂(36307ES)封片并用盖玻片密封。
10. 荧光显微镜观察成像。
更详细的免疫荧光实验方案详情见官网:免疫荧光实验全流程解决方案

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产品分类 |
产品货号 |
产品名称 |
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细胞培养基 |
DMEM高糖培养基 |
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DMEM/F12 培养基 |
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神经元基础培养基 |
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DMEM/F-12 减血清培养基 |
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重组蛋白 |
HiActi® Recombinant Human bFGF/FGF-2 Protein 重组人碱性成纤维细胞生长因子 |
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HiActi® Recombinant Human CNTF Protein重组人睫状神经营养因子 |
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HiActi® Recombinant Human EGF Protein 重组人表皮生长因子 |
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Laminin from Mouse EHS sarcoma 小鼠层粘连蛋白 |
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Recombinant Human Insulin 重组人胰岛素溶液(10mg/mL, 液体) |
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HiActi® Recombinant Human Noggin Protein 重组人Noggin蛋白(液体) |
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细胞培养相关试剂 |
Fetal Bovine Serum Gold Pro 胎牛血清(特级) |
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ACCUTASE细胞消化液 |
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Collagenase IV胶原酶IV型 |
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Ceturegel® Matrix hESC-Qualified,LDEV-Free 基质胶 |
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细胞培养用青霉素-链霉素(双抗) |
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50× 无血清NSC-27添加剂,等同于B-27 |
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100× MEM非必需氨基酸溶液(NEAA) |
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200 mM L谷氨酰胺 |
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0.4% 台盼蓝染色液 |
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DMSO二甲基亚砜(细胞培养级) |
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DAPI Fluoromount-G™ 抗荧光淬灭封片剂(含DAPI,水溶性) |
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生化试剂 |
1× PBS 细胞培养级 |
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PBS-BSA溶液(0.1%BSA,无菌,1×即用型) |
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无酶无菌水(未经DEPC处理) |
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超纯水 |
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L-抗坏血酸(维生素C) |
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小分子化合物 |
D(+)-Glucose,anhydrous |
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Y-27632 dihydrochloride |
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Triiodothyronine |
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Retinoic acid |
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DTT二硫苏糖醇 |
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丝裂霉素C |
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耗材 |
15 mL离心管灭菌袋装 |
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50mL离心管灭菌袋装 |
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6孔细胞培养板(TC处理) |
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12孔细胞培养板(TC处理) |
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100 mm培养皿 |
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200 μL加长滤芯吸头盒装灭菌 |

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