分子POCT：冻干qPCR试剂的技术突破

POCT （Point-of-Care Testing）即时检测，即床边现场检测，以快速、便捷、精准的特点，广泛应用于临床急诊、基层医疗、现场筛查等场景。传统液态 qPCR 试剂高度依赖冷链运输、储存，难以适配 POCT 即时检测的应用要求；而冻干 qPCR 试剂完美解决了这一痛点，高度契合 POCT 轻量化、易普及、免冷链的发展需求，现已成为分子 POCT 领域的热门核心技术。下面，我们就来梳理下冻干 qPCR 试剂发展至今、支撑其规模化落地的四大技术突破。

 

图1. 部分POCT设备展示

一、热敏性成分的有效保护

冻干qPCR试剂的核心痛点是热敏性成分（Taq酶、逆转录酶、核酸探针等）在冻干过程中易失活、复溶后活性难以恢复，早期冻干配方因保护剂选择单一、体系适配性差，导致试剂冻干后活性保留率偏低（不足80%），严重影响检测灵敏度。近年来，针对qPCR试剂配方优化实现关键突破，形成了“无甘油酶体系+复合保护剂”的核心方案，从源头解决活性保留难题。

1 无甘油酶体系

传统液态qPCR试剂中，甘油常作为酶的低温保护剂，但甘油会抑制冻干升华过程，导致试剂物理结构塌陷、复溶性能下降，还会增加冷链依赖。目前，无甘油Taq酶、无甘油逆转录酶等专用原料已实现产业化应用，经优化后的酶活性保留率可达到95%以上，与液态试剂性能基本一致，且在反复冻融、常温储存条件下仍能保持稳定。

2 复合保护剂体系

早期单一保护剂（如蔗糖、甘露醇）难以兼顾酶与核酸的双重保护需求，目前主流配方采用“低温保护剂+骨架支撑剂+协同保护剂”的复合方案：

主要保护剂类型	功能
蔗糖、海藻糖	在预冻阶段形成氢键，保护酶的空间构象与核酸的完整性。
甘露醇	作为骨架支撑剂，能在冻干后形成疏松多孔的海绵状结构，防止产品塌陷、结块，同时提升复溶性。
甘氨酸、BSA	作为协同保护剂，可减少氧化反应对热敏成分的损伤，进一步提升试剂稳定性。

此外，配方中还通过优化盐浓度、选用非挥发性缓冲液（磷酸/Tris-HCl，pH 6.0–7.0），避免冻干后pH漂移、共熔现象，提升批间一致性。

翌圣生物Zyme EditorTM酶改造平台通过理性设计和定向进化获取性能优异的酶原料，结合透析、切向流过滤等工艺去除甘油，再结合储液优化、反应buffer调试、冻干保护剂的筛选及组合测试、冻干参数的测定等，实现冻干产品性能不差于常规液体PCR试剂、冻干成品形态完整、储存稳定的RT-qPCR可冻干试剂。

仪器	7500	体系	25 μL
模板	转录RNA模板	模板浓度	105、104、103 copies/uL及1 copy/uL
对照组 （红色曲线）	20uL体系冻干（含引物探针），立即取1颗冻干球加20uL无酶水，5uL模板。
实验组 （蓝色曲线）	20uL体系冻干（含引物探针），冻干球于50℃放置30天，取1颗冻干球加20uL无酶水，5uL模板。
程序	50°C 2 min；95°C 30 sec；40 cycles (95°C 5sec；60°C 10 sec)

 

图2.翌圣RT-qPCR冻干球性能及稳定性展示

二、工艺精准化

冻干工艺的参数控制直接决定试剂的冻干质量，早期冻干工艺因预冻速率、真空度、升华温度等参数调控粗放，导致试剂残留水分过高、物理形态不均、批间差异大，难以满足POCT试剂的规模化生产需求。近年来，冻干工艺朝着“精准化、标准化、自动化”方向突破，形成了全流程参数可控的工艺体系。例如在预冻阶段，快速预冻与退火工艺的结合，有效减少冰晶对热敏成分的机械损伤。通过采用液氮或深冷板层制冷，实现1小时内将试剂降温至-40℃以下，减小冰晶尺寸，避免冰晶破坏酶的空间结构与核酸片段；同时引入退火工艺，消除体系应力、均化冰晶，提升后续升华干燥效率。经优化后的冻干qPCR试剂，在25℃密封条件下可稳定储存12–24个月，无需冷链运输，大幅降低物流与储存成本。

表1. 冻干各个环节中的影响因素

 

三、多种形态，满足不同需求

多种冻干形态的出现，满足不同场景需求。原位冻干和冻干球将qPCR反应体系（酶、引物、探针、缓冲液等）冻成均一的形态，使用时，只需向冻干粉/球中加入样本核酸即可，无需额外配制反应体系，实现“加样即检测”，大幅缩短检测时间。

此外，冻干体系可兼容更高的模板投入量，进一步提高检测体系的灵敏度和可靠性。

图3.原位冻干及冻干球形态展示 

四、质控体系完善

分子POCT检测的核心要求是精准可靠，早期冻干qPCR试剂因质控体系不完善，易出现假阳性、假阴性、检测偏差等问题，限制了其临床应用。近年来，质控体系的完善成为技术突破的重要方向。在全流程质控方面，建立了从原料到成品的全链条质控标准，原料层面确保原料质量稳定；冻干工艺层面确保工艺一致性；成品层面，确保成品性能达标，冻干前后扩增效率偏差控制在5%以内，在污染防控方面，引入dUTP/UDG防污染系统；同时采用单项目冻干、腔室清洁、微粉捕集等措施。

 

未来，随着分子POCT技术的不断迭代，冻干qPCR试剂将朝着“更高灵敏度、更快速、更微型化”的方向发展，推动分子POCT技术向更广泛的场景普及，为精准医疗、公共卫生防控提供更有力的技术支撑。

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冻干保护剂	13743ES	冻干保护剂V2
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RNA酶抑制剂	10703ES	Murine RNase inhibitor (200 U/μL, Glycerol-free)
	10701ES	Murine RNase inhibitor (40 U/μL , Glycerol-free)
taq酶	13705ES	Hieff Unicon® Hotstart J-Taq DNA Polymerase, 6 U/μL, Glycerol-free 通用性强、可冻干的热启动Taq酶
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	14326ES	Hieff Unicon® Hotstart J-Taq DNA Polymerase, Glycerol-free(40 U/μL) 13705的高浓度版本
逆转录酶	14617ES	Hifair UCF. ME® Advanced Reverse Transcriptase, Glycerol-free(200 U/μL)
	11301ES	Hifair® V Reverse Transcriptase (600 U/μL, Glycerol-free)
BST酶	14405ES	Lyophilized Bst Plus DNA Polymerase Bst DNA聚合酶冻干粉(60 U/μL，Glycerol-Free)
LAMP试剂	13920ES	RT-LAMP pH Sensitive Dye Chromogenic Version Freeze-Dryable Kit RT-LAMP试剂（PH指示剂法，可冻干）