猪繁殖与呼吸综合征的背景、采样方法、检测方法以及RT-qp的提取+qp实验步骤以及检测优势

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2026-10-12

疾病背景

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS），俗称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种高度接触性传染病。该病毒属于动脉炎病毒科，具有高度变异性和强免疫抑制特性。临床上主要分为两大毒株：欧洲型（PRRSV-1）和美洲型（PRRSV-2）。

蓝耳病对养猪业危害极大，主要特征为母猪繁殖障碍（流产、早产、死胎）及仔猪呼吸道症状（呼吸困难、肺炎）。此外，PRRSV极易破坏猪的免疫系统，常与猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟（CSFV）、伪狂犬（PRV）等混合感染，造成严重的继发性细菌疾病，给养殖场带来巨大的经济损失。

临床外观症状（“蓝耳” 特征）

规范采样方法

准确的采样是精准检测的前提。根据检测目的和临床阶段，推荐以下采样策略：

1、母猪群采样

血清：耳静脉采血，用于评估群体抗体水平及野毒感染情况。
流产胎儿：采集流产胎儿的心血、肺脏、脾脏或扁桃体。

2、仔猪/育肥猪采样

口腔液（Oral Fluids）：使用棉绳或纱布让猪咀嚼，采集混合口腔液。此法应激小，适合群体早期筛查，病毒载量高时检出率极佳。
血清：常规个体检测。
鼻拭子/咽拭子：适用于急性期呼吸道症状明显的猪只。

3、精液采样

精液采样：公猪精液检测，用于排查精液传播风险。

注意：样本采集后应尽快低温保存（4℃短期或-20℃/-80℃长期），避免反复冻融导致RNA降解。

主流检测方法对比

方法	原理	优点	缺点	适用场景
ELISA（抗体检测）	抗原抗体反应	操作简便，成本低，适合大群普查	无法区分疫苗毒与野毒，窗口期长	免疫效果评估、群体监测
病毒分离	细胞培养	金标准，可研究病毒特性	耗时长（数周），条件苛刻	科研、新毒株分析
RT-qPCR（核酸检测）	荧光定量PCR扩增	灵敏度高、特异性强、出结果快（1-2h），可定量	设备成本较高，需专业实验室	早期诊断、净化评估、阳性确认

RT-qPCR因其能够在感染早期（抗体尚未产生时）精准检出病毒核酸，已成为目前猪场确诊PRRS和进行病毒载量监控的核心手段。

RT-qPCR实验全流程

一套标准的PRRSV核酸检测流程包含核酸提取与qPCR扩增两大步骤。以下以翌圣（Yeasen）试剂为例演示标准操作：

第一步、病毒RNA提取（以磁珠法为例）

推荐试剂：MolPure® Magnetic Universal Viral DNA/RNA Kit (Cat#18521ES)

1.裂解释放：取200μL血清或组织匀浆上清，加入裂解结合液、蛋白酶K与磁珠，涡旋混匀，50℃振荡温浴5~7min。磁珠表面的特异性涂层将高效捕获病毒RNA。
2.洗涤除杂：置于磁力架上吸附磁珠，弃上清。依次加入洗涤液A和洗涤液B，充分重悬磁珠后再次吸附弃液，彻底去除蛋白、抑制剂及杂质。
3.洗脱收集：加入无核酸酶水洗脱液，60℃加热洗脱5 min，磁性分离后收集上清液，即为高纯度病毒RNA，可直接用于qPCR。

第二步、一步法RT-qPCR检测

推荐试剂：Hifair® C203P1 Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG Plus)二代通用、高灵敏RT-qPCR预混液 (Cat#16630ES)

注：模板RNA和引物探针（Primer Mix和Probe Mix）需要自备。

体系配制（以25μL体系为例）：

上机扩增程序

结果判定：Ct值<35判为阳性；Ct值>38判为阴性；35-38之间建议复测。

检测优势与核心亮点

1、超高灵敏度

磁珠法提取效率高，配合优化的一步法酶系，可精准检出低拷贝病毒，不漏检早期感染猪只。

2、防污染设计（UDG Plus）

试剂盒内置 dUTP/UDG 防污染系统，能有效降解气溶胶中的扩增产物，从根本上避免PCR实验室常见的假阳性问题。

3、抗抑制力强

提取试剂针对血清、口腔液等复杂基质优化，有效去除血红素、黏液等PCR抑制剂，确保Ct值准确稳定。

4、高通量兼容

磁珠法完美适配翌圣 AP-16/48/96 系列全自动核酸提取仪，单日可完成数百份样本检测，大幅提升实验室效率。

翌圣检测相关产品推荐表

货号	产品名称	核心特点
18521ES	MolPure® 磁珠法通用病毒DNA/RNA提取试剂盒	兼容全血/血清/拭子等多类样本；磁珠法纯度高；支持手工及自动化提取。
16930ES	Hifair® Universal Advanced Multiplex One Step RT-qPCR Mix (UDG Plus) 三代通用、高灵敏、耐抑制RT-qPCR预混液	通用性强；dUTP/UDG 防污染系统；支持快速程序<35 min。
16983ES	Hifair® Multiplex Superfast One Step RT-qPCR Probe Mix（UDG Plus）	支持快速程序；dUTP/UDG 防污染系统。
16921ES	Hifair® Advanced One Step RT-qPCR Probe Mix (UDG Plus) 高灵敏高乘数（5×）RT-qPCR预混液（一管式）	高灵敏高乘数（5×）；dUTP/UDG 防污染系统。
13650ES	Hifair® V C58P2 Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG Plus)一代通用RT-qPCR预混液	灵敏度低至250 copies/mL；dUTP/UDG 防污染系统；支持快速程序40 min。
16913ES	Hifair® Superpro Fast One Step RT-qPCR Master Mix (UDG Plus) 二代快速、全预混RT-qPCR预混液	全预混（酶和buffer一管）；支持40min快速程序；dUTP/UDG 防污染系统；引物探针提前预混，37℃放置5天性能稳定。
11899ES	Hifair® Superpro Ⅱ One Step RT-qPCR Master Mix 一代通用、全预混RT-qPCR预混液	全预混（酶和buffer一管）；更适合常规1h的程序；引物探针提前预混，37℃放置5天性能稳定；dUTP/UDG防污染体系。
80512ES	AP-16S 16通道全自动核酸提取仪	16通道同步提取；磁棒套防交叉污染；操作简便，适合中小型实验室高通量需求。
80511ES	AP-48S 48通道全自动核酸提取仪	48通道同步提取；磁棒套防交叉污染；操作简便，适合中小型实验室高通量需求。
80510ES	AP-96S 96通道全自动核酸提取仪	96通道同步提取；磁棒套防交叉污染；操作简便，适合大型实验室高通量需求。