猪流行性腹泻的背景、采样方法、检测方法以及RT-qPCR的提取+PCR实验步骤以及检测优势
猪流行性腹泻的背景、采样方法、检测方法 以及RT-qPCR的提取+PCR实验步骤以及检测优势
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2026-10-13
猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，主要侵害猪的消化道，以呕吐、水样腹泻、脱水为典型症状，不同年龄段猪均易感，仔猪病死率极高（新生仔猪可达80%~100%），育肥猪和成年猪多为隐性感染或轻度腹泻，康复后可获得短期免疫力。
PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，对外界环境抵抗力较弱，对酸、碱、消毒剂敏感，但在低温潮湿环境中可存活数天，主要通过接触传播，经消化道感染，规模化猪场一旦暴发，可快速扩散至全群，造成严重的经济损失，是影响养猪业健康发展的重要传染病之一，目前已被列为我国重点防控的猪传染病。
采样的核心是保证样品新鲜、无污染、有代表性，避免因采样不当导致检测结果假阴性或假阳性，具体方法如下：
发病初期（发病1~3天内），此时病猪体内病毒载量最高，检测准确率最高；优先采集出现典型症状（呕吐、水样腹泻）的病猪，避免采集病程后期或已康复的猪只。
用无菌棉签或采样勺，采集病猪新鲜粪便（约5~10g），避免接触土壤、垫料等污染物，放入无菌离心管中，做好样品标记（猪只编号、采样日期、采样部位）。
对病死仔猪，无菌操作下解剖，采集十二指肠、空肠、回肠组织（各约2~3g），去除肠道内容物，放入无菌冻存管中，立即冷藏或冷冻保存。
用无菌容器采集病猪新鲜呕吐物（约5ml），避免污染，密封后标记保存。
采样后立即置于4℃冷藏（短期保存，不超过24h），如需长期保存，放入-80℃冷冻；运输时用保温箱，加入冰袋，避免样品反复冻融，确保样品在运输过程中保持低温，同时附样品信息单，注明采样地点、猪群情况、症状等。
目前猪流行性腹泻的检测方法主要分为血清学检测和分子生物学检测两大类，其次就是病毒分离培养法，各有优劣，可根据检测需求选择：
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检测方法 |
血清学检测 |
分子生物学检测 |
病毒分离培养法 |
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检测对象 |
病猪血清中的PEDV特异性抗体 |
病毒核酸（RNA） |
纯病毒菌株 |
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应用 |
回顾性诊断、免疫效果评估 |
早期诊断、快速筛查 |
病毒分型和疫苗研发 |
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方法 |
酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA） |
RT-PCR、RT-qPCR、荧光定量RT-PCR等 |
细胞分离培养法、动物接种分离法、组织培养分离法、克隆纯化培养法 |
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优势 |
操作相对简便、成本较低，可批量检测 |
灵敏度和特异性均高于血清学检测 |
结果最权威、金标准级别，可获得完整活病毒毒株，可进行毒株分型、毒力测定 |
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劣势 |
检测的是抗体，发病初期（感染后7~10天内）抗体未产生，易出现假阴性，无法用于早期诊断。 |
对实验条件与设备要求高，存在假阳性风险，不能用于大批量现场快速临场检测 |
操作复杂、耗时较长（需3~7天），不适合常规快速检测。 |
一套标准的PEDV核酸检测流程包含核酸提取与qPCR扩增两大步骤。以下以翌圣（Yeasen）试剂为例演示标准操作：
推荐试剂：MolPure® Magnetic Universal Viral DNA/RNA Kit (Cat#18521ES)
取200μL血清或组织匀浆上清，加入裂解结合液、蛋白酶K与磁珠，涡旋混匀，50℃振荡温浴5~7min。磁珠表面的特异性涂层将高效捕获病毒RNA。
置于磁力架上吸附磁珠，弃上清。依次加入洗涤液A和洗涤液B，充分重悬磁珠后再次吸附弃液，彻底去除蛋白、抑制剂及杂质。
加入无核酸酶水洗脱液，60℃加热洗脱5 min，磁性分离后收集上清液，即为高纯度病毒RNA，可直接用于qPCR。
推荐试剂：Hifair® Universal Advanced Multiplex One Step RT-qPCR Mix (UDG Plus) 三代通用、高灵敏、耐抑制RT-qPCR预混液 (Cat#16930ES)
注：模板RNA和引物探针（Primer Mix和Probe Mix）需要自备。
体系配制（以25μL体系为例）：
上机扩增程序（二选一）：
设置阳性对照（已知PEDV阳性RNA）、阴性对照（DEPC水）、空白对照（无模板），若样品Ct值≤35，且溶解曲线单一（无杂峰），判定为阳性；Ct值＞35或无Ct值，判定为阴性；阳性对照Ct值正常、阴性对照无Ct值，实验才有效。
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1）全程严格无菌操作，避免RNA酶污染（实验器具需用DEPC水浸泡处理，操作人员戴手套、口罩）；
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2）RNA易降解，全程低温操作，避免反复冻融；
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3）引物、探针需低温保存，配制时严格按照比例，避免浓度偏差；
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4）反应体系配制需在冰上进行，避免酶失活。
相比其他检测方法，RT-qPCR检测PEDV具有显著优势，是目前临床首选的快速检测方法，具体优势如下：
可检测到极低浓度的PEDV RNA（最低检测限可达10 copies/μl），发病初期（感染后1~2天）即可检测到病毒，避免漏检，适合早期诊断和疫情筛查。
采用PEDV特异性引物和探针，仅与PEDV核酸结合，不与其他猪肠道病毒（如猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒）发生交叉反应，检测结果准确，减少假阳性。
整个实验流程（核酸提取+PCR扩增）仅需3~4小时，可批量检测（一次可检测96个样品），相比病毒分离（3~7天）、血清学检测（需等待抗体产生），大幅缩短检测时间，便于快速采取防控措施。
可通过Ct值定量分析病猪体内的病毒载量，判断病情严重程度，同时可用于评估防控效果和疫苗免疫后的病毒清除情况。
无需复杂的实验设备（仅需RT-qPCR仪），流程标准化，经过简单培训即可操作，适合规模化猪场、基层兽医站等场景使用。
可检测粪便、肠道组织、呕吐物等多种样品，对不同年龄段的病猪均适用，同时可用于隐性感染猪的筛查，实现早发现、早防控。
综上，RT-qPCR凭借灵敏度高、特异性强、快速高效等优势，已成为猪流行性腹泻防控中最核心的检测技术，结合规范的采样方法和背景认知，可有效实现PED的早期诊断和精准防控，减少养殖损失。
翌圣检测相关产品推荐表
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货号 |
产品名称 |
核心特点 |
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MolPure® 磁珠法通用病毒DNA/RNA提取试剂盒 |
兼容全血/血清/拭子等多类样本；磁珠法纯度高；支持手工及自动化提取。 |
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Hifair® Universal Advanced Multiplex One Step RT-qPCR Mix (UDG Plus) 三代通用、高灵敏、耐抑制RT-qPCR预混液 |
通用性强；dUTP/UDG 防污染系统；支持快速程序<35 min。 |
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16983ES |
Hifair® Multiplex Superfast One Step RT-qPCR Probe Mix（UDG Plus） |
支持快速程序；dUTP/UDG 防污染系统。 |
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Hifair® Advanced One Step RT-qPCR Probe Mix (UDG Plus) 高灵敏高乘数（5×）RT-qPCR预混液（一管式） |
高灵敏高乘数（5×）；dUTP/UDG 防污染系统。 |
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Hifair® V C58P2 Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG Plus)一代通用RT-qPCR预混液 |
灵敏度低至250 copies/mL；dUTP/UDG 防污染系统；支持快速程序40 min。 |
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Hifair® Superpro Fast One Step RT-qPCR Master Mix (UDG Plus) 二代快速、全预混RT-qPCR预混液 |
全预混（酶和buffer一管）；支持40min快速程序；dUTP/UDG 防污染系统；引物探针提前预混，37℃放置5天性能稳定。 |
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Hifair® Superpro Ⅱ One Step RT-qPCR Master Mix 一代通用、全预混RT-qPCR预混液 |
全预混（酶和buffer一管）；更适合常规1h的程序；引物探针提前预混，37℃放置5天性能稳定；dUTP/UDG防污染体系。 |
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AP-16S 16通道全自动核酸提取仪 |
16通道同步提取；磁棒套防交叉污染；操作简便，适合中小型实验室高通量需求。 |
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AP-48S 48通道全自动核酸提取仪 |
48通道同步提取；磁棒套防交叉污染；操作简便，适合中小型实验室高通量需求。 |
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AP-96S 96通道全自动核酸提取仪 |
96通道同步提取；磁棒套防交叉污染；操作简便，适合大型实验室高通量需求。 |
