实验所用转染试剂

试剂名称	货号
Hieff Trans®RNAiBoost Transfection Reagent转染试剂	40807ES

细胞培养与传代（T25）

细胞计数：从培养箱取出细胞，细胞悬液吹打混匀，使用细胞计数仪检测细胞活率及密度。

细胞传代（直接稀释法）：根据计数结果，将细胞按照5E5 cell/mL左右进行细胞传代。

细胞传代（半换液法）：若待传代细胞上清较黄，取出细胞后，使细胞继续保持静置状态，将培养板微微倾斜，使细胞沉于底部，用移液器将细胞上清液去除，再补充新鲜培养基进行计数传代。

细胞传代（离心换液法）：若细胞状态不好，可以通过低速离心进行传代；将待传代细胞悬液移至无菌离心管中，200 ×g 离心3-5分钟，新鲜培养基重悬并计数传代。

细胞转染（12孔板）

一、实验前准备

1. 细胞准备：转染时。以合适的密度（2E5/mL）将细胞接种于12孔板中，每孔加入1 mL完全培养基。

2. 试剂准备：

o siRNA： 合成高质量siRNA，通常设计3个不同siRNA进行验证，初始浓度调整成20μM。

o 转染试剂： 将RNAiBoost试剂在4°C冰箱外静置回温，使用前轻轻吹打。

o 无血清培养基： 准备用于稀释siRNA和转染试剂的基础培养基（如Opti-MEM）。

二、细胞转染

1. 稀释siRNA：吸取2.5 μL siRNA溶液与12.5 μL Enhancer增强剂溶液充分吹打混匀；

2. 稀释转染试剂：吸取5 μL RNAiBoost体外转染试剂溶液与（1）中溶液混合，并充分吹打混匀，室温孵育5 min。

3. 细胞转染：孵育结束后，向（2）中混合溶液加入30 μL的opti-MEM转染稀释液，并充分吹打混匀，随后将混合后的50 μL转染复合物加入到12孔板的一个孔中，摇动混匀培养板中的液体，可根据需要的孔量进行配制转染复合物。

4. 细胞培养及检测：将细胞放回37°C、5% CO₂培养箱中培养；24 -48 h后检测细胞基因沉默水平。

四、转染后处理

1. 换液：转染后4-6小时，仔细观察细胞状态。若出现明显毒性，应吸弃含复合物的培养基，更换为1 mL新鲜预热的完全培养基。若细胞状态良好，可以不换液。本次实验不换液

2. 检测：通常培养48小时后，提RNA进行检测。本次实验转染后48h进行WB检测。

小贴士：

1、如果转染后有显著的细胞毒性，可以在6h换液或将用量减半，可以避免细胞毒性问题；

2、如果转染效率比较低，可以通过提高转染试剂用量，能够有效提高转染效率；

3、稀释siRNA和转染试剂，最好使用opti-MEM；

4、转染试剂兼容血清和双抗，但是稀释质粒和转染试剂用的必须是无血清无双抗培养基。

5、需严格按照表格中推荐用量进行转染复合物制备，如若增加或减少用量，需要等比例减少，以6孔板为例，若按照终浓度50nM进行实验，则按照说明书配置100ul转染复合物即可，若需要用量翻倍，需要配置200ul转染复合物添加到孔板中；相反，若用量减半，按照表格推荐用量，配置好的100ul转染复合物，只需要添加50ul即可。

实验结果分析

在CEMT-4，HTLV-1感染的人类白血病T细胞转染siRNA，用翌圣 RNAiBoost转染，并通过WB检测转染效率。

数据来源：中国药科大学

使用翌圣 RNAiBoost转染试剂在CEMT-4人类白血病T细胞转染siRNA，结果显示，翌圣RNAiBoost 转染试剂能够高效转染，显著降低目的基因表达。

不同培养皿RNAiBoost转染试剂用量使用指南

细胞培养板	细胞培养基体积	siRNA溶液（原液浓度20 μM）	增强剂	转染试剂	无血清培养基体积	转染复合物体积
24孔板	500 μL	1.25 μL	6.25 μL	2.5 μL	15 μL	25 μL
12孔板	1.0 mL	2.5 μL	12.5 μL	5 μL	30 μL	50 μL
6孔板	2.0 mL	5 μL	25 μL	10 μL	60 μL	100 μL

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