Multi-CUT&Tag技术最全原理解析

2022年，翌圣生物首次推出CUT&Tag实验中添加Spike in（CUT&Tag实验spike in的优势早知道），解析了CUT&Tag实验中的pA/G-Tn5的原理（CUT&Tag实验中，Protein A/G的巧妙选择），并推出了CUT&Tag进阶手册（跟着宝典走，三天成高手，《CUT&Tag进阶手册》限量赠送），全流程解析CUT&Tag实验的实验技巧及实验注意事项和分析流程。

2023年，翌圣生物全球首发Multi-CUT&Tag试剂盒（CUT&Tag2for1照进现实，Multi-CUT&Tag试剂盒全球首发），产学研合作，使得同一份细胞实现双靶标的研究。

随着Multi-CUT&Tag试剂盒的推出，越来越多科研工作者咨询Multi-CUT&Tag的一些相关问题，今天，我们来对Multi-CUT&Tag技术原理进行最全解析。

Multi-CUT&Tag实验流程及原理

实验原理：利用ConA磁珠捕获细胞并利用5% Digitonin对细胞膜进行穿孔，选择鼠源一抗和兔源一抗实现同一细胞双靶标研究，之后，鼠源一抗结合Anti-mouse Tn5、兔源一抗结合Anti-rabbit Tn5从而定向切割不同靶标靶向的目标蛋白结合DNA序列，再经过PCR完成二代测序文库的构建。对文库进行测序后的数据进行barcode拆分，即可获得双靶标的高分辨率靶蛋白结合的染色质图谱。

图：Multi-CUT&Tag实验流程

Multi-CUT&Tag试剂盒组分原理

Multi-CUT&Tag试剂盒为即用型试剂盒，试剂盒中含有Box I和Box II，存放温度不一致。试剂盒中，包含Digitonin和纯化磁珠，客户准备好样品、磁力架、PCR仪、涡旋仪以及所需实验的鼠抗和兔抗，搭配固定货号接头，即可完成实验。

	组分名称	组分原理
BOX-I	ConA Beads	ConA beads为包被有伴刀豆蛋白A的磁珠，结合细胞膜糖蛋白，从而捕获细胞
	DNA Selection Beads	DNA纯化及分选磁珠
	Cell wash buffer	细胞洗涤缓冲液
	ConA bind buffer	细胞捕获缓冲液
BOX-II	Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free)	抑制蛋白酶活性
	5% Digitonin	增加细胞膜通透性，在细胞表明打孔，便于后续转座切割
	3M NaCl	减少非特异结合
	50x Protein blocker	减少一抗非特异结合
	Anti-mouse Tn5	偶联抗原二抗的Tn5复合体
	Anti-rabbit Tn5	偶联抗原二抗的Tn5复合体
	50x Activating buffer	含镁离子，激活Tn5转座活性
	15x Terminate Solution	终止转座酶活性，同时裂解细胞，释放DNA
	DNA Spike-in mix	来源于EcoII的三段序列，用于后续分析的标准化
	30x Proteinase K	消化蛋白质，释放蛋白质结合的DNA
	2-Ultima Amplification Mix	文库扩增酶
	N5(N701) *	文库接头，含测序index

Multi-CUT&Tag技术高分文章应用

Multi-CUT&Tag技术在鼠脑中的研究应用

2022年12月，Gonçalo Castelo-Branco课题组在Nature Biotechnology上发表的Multimodal chromatin profiling using nanobody-based single-cell CUT&Tag上推出了使用纳米抗体-Tn5融合蛋白的nano-CUT&Tag（nano-CT），通过Anti-mouse Tn5和Anti-Rabbit Tn5，在鼠脑中实现特异性针对鼠抗和兔抗的Multi-CUT&Tag技术应用，非常详细地解剖大脑中的祖细胞如何特化成少突胶质细胞，这些新的机制见解可以为我们在疾病背景下如何刺激少突胶质细胞群的恢复提供线索。

图：nano-CUT&Tag (nano-CT)在单细胞技术中的应用

nano-CUT&Tag能减少实验流程，并且在单细胞水平背景更低，同时分群结果更明显。

Multi-CUT&Tag技术在不同免疫细胞中的研究应用

2022年12月，美国纽约基因组中心Ivan Raimondi团队Nature Biotechnology上发表的Nanobody-tethered transposition enables multifactorial chromatin profiling at single-cell resolution上推出NTT-seq，在不同细胞中使用纳米抗体偶联的Tn5酶实现了同一份细胞多个靶标的研究，同时该研究在PBMCs和BMMCs中进行单细胞多靶标CUT&Tag研究时，也能获得非常优秀的高分辨率的多模态图。同时，研究人员还扩展了NTT-seq，使细胞表面蛋白表达和多模态染色质状态的分析同时进行，可用于研究免疫系统的细胞。

图：NTT-seq在不同细胞中实现bulk多靶标的染色质图谱

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产品名称	货号	规格
Hieff NGS^® Multi-CUT&Tag Library Prep Kit for Illumina^®	12592ES12/48	12T/48T
Hieff NGS^® DNA Spike in Mix for CUT&Tag	12596ES48	48T
Hieff NGS^® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina^® CUT&Tag建库试剂盒	12598ES12/48	12T/48T

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参考文献：

[1] B. M, CB G. Multimodal chromatin profiling using nanobody-based single-cell CUT&Tag [published online ahead of print, 2022 Dec 19]. Nat Biotechnol. 2022;10.1038/s41587-022-01535-4. doi:10.1038/s41587-022-01535-4[IF:68.164]

[2] Stuart T, Hao S, Zhang B, et al. Nanobody-tethered transposition enables multifactorial chromatin profiling at single-cell resolution [published online ahead of print, 2022 Dec 19]. Nat Biotechnol.

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