• 用适量预冷的Ceturegel^® 基质胶(40192ES)重悬上述细胞沉淀（保持在冰上操作）。对于小鼠组织，每个接种点目标为20，000个细胞。

• 将细胞- 基质胶悬液以 40 μl 的体积，滴加在24孔板每个孔的中心位置，形成一个独立的胶滴。

• 立即将培养板倒置放入37°C、5% CO₂培养箱中，孵育 15分钟，使Ceturegel^® 基质胶完全凝固。

• 沿孔壁缓慢、轻柔地加入 500 μl 事先预热至37°C的、含10 μM Y-27632 的小鼠前列腺完全培养基。

• 将培养板放回培养箱正常培养。每2-3天更换一次新鲜培养基（前7天的培养基需含Y-27632，7天后更换为不含Y-27632的常规完全培养基）。

• 通常在接种后2-3天可见微小细胞团，约 7天 后形成典型的囊状或实心类器官结构。

图2.小鼠前列腺类器官培养

• 当类器官生长密集、直径适中时（约培养7-10天后），可进行传代。

• 吸弃孔内培养基，用移液器将含有类器官的基质胶胶块吹打下来，收集到15 ml离心管中。

• 使用火焰抛光过的玻璃巴斯德吸管（尖端直径约0.5-1 mm），用力吹打细胞团 15-20次，将其机械破碎成更小的细胞簇（而非单细胞）。

• 加入适量预冷Ceturegel® 基质胶重悬细胞。按1：4的比例进行传代，即：将原孔的全部细胞悬液，平均分配接种到4个新的孔中，每孔仍使用40 μl Ceturegel® 基质胶液滴。

• 后续培养步骤同上（传代后的前7天，培养基中需添加Y-27632）。

• 将获取的人前列腺正常组织或转移灶活检组织（体积不小于1 mm³），切割成 1-5 mm³ 的小块。

• 与小鼠流程类似，使用含Y-27632和DHT的 5 mg/ml胶原酶II消化液（1 ml/50 mg组织）进行消化。关键区别在于消化时间：
  正常前列腺组织：需在37°C摇床上消化 过夜（约16小时）。
  前列腺癌转移灶组织：消化 1小时 即可。

• 后续的TrypLE消化（15分钟，每5分钟吹打）、洗涤步骤与小鼠流程（第二部分1⑤-⑦步）完全相同，离心力调整为 200g。

• 用Ceturegel^® 基质胶重悬细胞。

  正常组织：建议每孔接种 约20，000个细胞（40 μl Ceturegel^® 基质胶）。

  癌转移灶组织：为克服肿瘤细胞可能生长较慢的问题，建议提高接种密度至 约50，000个细胞/孔（40 μl Ceturegel^® 基质胶）。

• Ceturegel^® 基质胶凝固、加培养基等步骤与小鼠流程一致，但此处加入的是人前列腺完全培养基（前7天含Y-27632）。

• 正常组织来源的类器官通常在 7-14天 后可长至适合传代的大小。癌组织来源的生长速度变异较大，需密切观察。

• 人类器官（尤其正常组织来源的）推荐使用酶解法传代。

• 收集类器官后，加入 0.5 ml 含10 μM Y-27632的TrypLE，37°C消化 5分钟。

• 加入 5 ml 含5%胎牛血清的Advanced DMEM/F12以中和消化酶，随后以 200g 离心5分钟，弃上清。

• 用Ceturegel® 基质胶重悬细胞。按1：2的比例进行传代，即：将原孔的细胞悬液，平均分配接种到2个新的孔中。

• 加入含Y-27632的培养基培养7天后，换用常规完全培养基。

• CTCs分离：取8 ml晚期前列腺癌患者外周血，与 400 μl 人CD45去除cocktail室温孵育20分钟。采用Ficoll密度梯度离心法（1200g，20分钟，关刹车）分离单个核细胞层，并用PBS+2% FBS洗涤两次。

• 直接接种：将分离得到的细胞沉淀，不经计数，直接重悬于 30 μl 冰预冷Ceturegel® 基质胶中。

• 在24孔板中央滴加 30 μl 细胞Ceturegel® 基质胶悬液，凝固后，加入 500 μl 含Y-27632的人前列腺完全培养基。

• 培养与观察：每2-3天换液。由于CTCs数量稀少，需在显微镜下仔细观察，可能需 1-2周 才能看到极少量类器官生长。