粪便微生物研究 - 翌圣生物

粪便微生物研究

2026-10-16

导读

肠道是人体内微生物密度最高、多样性最丰富的生态系统。人胃肠道中栖息着由细菌、古菌、真菌和病毒构成的复杂动态微生物群落，在营养代谢、免疫调节和肠道屏障完整性维持中发挥关键作用。粪便样本作为肠道微生态的“信息窗口”，其微生物组成分析已成为揭示宿主-微生物互作的核心手段。传统培养方法仅能捕获部分微生物类群，大量功能微生物长期无法被认知。高通量测序（NGS）技术的成熟，使研究者能够绕开培养过程，直接解析粪便微生物群落的物种组成和功能潜力。

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背景

长期以来，粪便微生物研究依赖于平板培养和镜检等方法，存在通量低、分辨率有限等弊端。随着高通量测序和宏组学的不断发展，研究者能够直接对粪便样本中的微生物群体基因组进行分析，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性及与环境之间的关联为研究目的。

16S rRNA基因扩增子测序是最广泛应用的细菌/古菌分类工具。16S rRNA基因存在于所有原核生物中，由保守区和可变区交替排列，保守区可用于通用引物设计，可变区携带物种特异的进化信息。采用V3-V4等可变区进行扩增子测序，可系统揭示样本中微生物群落的物种组成、丰度分布和进化关系。宏组学测序对粪便样本中的全部DNA/RNA进行无偏倚测序，与16S扩增子测序相比可在菌株水平进行物种识别，并提供详细的功能潜能信息。

图1. 肠道菌群概述、产生的主要代谢物及其作用靶点

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技术应用

人群队列健康评估与基线调查

利用NGS对大规模人群队列进行肠道菌群谱系分析，有助于建立不同地域、年龄及生活习惯人群的参考标准。意大利一项涉及109例普通人群队列粪便拭子的研究显示，厚壁菌门（Firmicutes）为丰度最高的菌门（51.1%），紧随其后的是拟杆菌门（Bacteroidetes，38.3%）和放线菌门（Actinobacteria，3%）。研究还发现特定微生物类群与年龄、性别、抗炎药物使用、吸烟和过敏之间存在显著关联。该研究为未来揭示区域微生物组成差异及其对健康影响奠定了基础。

结直肠癌筛查与疾病预测

粪便样本的微生物组谱系已被证实可精准预警结直肠癌等疾病。一项基于功能宏基因组学的结直肠癌研究对患者和健康对照进行测序，发现厚壁菌门/变形菌门（Bacillota/Pseudomonadota）比值在结直肠癌组为2.45，显著高于健康对照组的0.70，增幅超3倍。在糖基转移酶中，GT1、GT2和GT4在结直肠癌组显著富集，而糖苷水解酶GH5和GH9则明显下降，GT/GH比值在结直肠癌组从1.37升至3.94。这些酶谱变化反映了肠道菌群在癌症发生过程中的代谢重编程特征。

粪菌移植的疗效机制解析

粪菌移植（FMT）已成为治疗多种肠道疾病和菌群失调的新兴手段。一项涵盖8000多名患者的综述显示，FMT在肠道疾病（包括艰难梭菌感染性腹泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激综合征和结直肠癌术后综合征）以及肠外疾病方面均展现出一定疗效。在热应激诱导的小鼠结肠损伤模型中，FMT显著调节了肠道菌群组成，增加了Alistipes、Bifidobacterium、Christensenellaceae等有益菌属的相对丰度，降低了Clostridium_sensu_stricto_1和Bilophila等菌属的丰度，并通过恢复黏膜屏障完整性、抑制上皮细胞凋亡和降低氧化应激来减轻热诱导的结肠损伤。NGS技术的应用为评估FMT前后受体微生物组的重构效果提供了核心数据支撑。

营养科学与饮食干预评估

在精准营养和食品功效评价中，肠道菌群检测已成为关键评估指标之一。研究者通过比较干预前后粪便样本中特定有益菌（如双歧杆菌、乳酸杆菌）的丰度变化，评估益生元、益生菌或膳食补充剂的功效，同时通过检测有害菌的丰度评估食物成分的安全性。

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常见实验步骤

样本采集与保存

粪便样本的质量是决定研究成败的首要因素。粪便采集建议：粪便表层接触空气或尿液，建议取中后段内部样本，避免表面菌群干扰。采取无菌采集，采集后尽快分装，液氮速冻后-80℃保存，避免反复冻融。

核酸提取

DNA提取：

提取质量直接影响建库成败，建议考虑采用机械裂解（0.1 mm锆珠震荡）+化学裂解双重破壁，确保有效提取。

RNA提取：

宏转录组对RNA完整性和纯度要求更高：全程在无RNase环境下操作，使用DEPC处理耗材。提取后RNA需检测OD260/280及完整性。

文库构建

根据测序目标选择建库策略：

16S/ITS扩增子建库：

采用两步PCR法，靶向V3-V4区或ITS等区域。

宏基因组建库：

采用酶切法或超声打断片段化DNA，经末端修复、加A尾、连接接头后PCR扩增。也可以基于Tn5转座酶的“一步法”建库试剂盒可在2.5小时内完成建库，起始量低至1 ng。

宏转录组建库：

流程相对复杂

rRNA去除：

总RNA中rRNA占比超过90%，需通过探针杂交去除。

链特异性建库：

逆转录合成cDNA第一条链后，第二链合成时以dUTP取代dTTP，保留链方向信息。链特异性文库可提供更精准的基因定量和反义转录本信息。

高通量测序

扩增子测序：

Illumina MiSeq/NovaSeq平台，PE250或PE300模式，每个样本建议5-10万条序列。

宏基因组测序：

Illumina NovaSeq或DNBSEQ-T7平台，PE150模式，数据量5-10 Gb/样本（物种组成）或10-20 Gb/样本（功能解析）。

全长16S测序：

PacBio/ONT平台，读长>1400 bp，直接获取完整可变区信息，分辨率达种水平。

宏转录组测序：

Illumina NovaSeq平台，PE150，每个样本10-20 Gb数据。

生物信息分析

核心分析内容：

质控与去噪：

FastQC、cutadapt、DADA2

物种注释：

SILVA、Greengenes、Kraken2、MetaPhlAn4

功能注释：

PICRUSt2、HUMAnN3、KEGG、COG

抗性基因分析：

ARGs-OAP v3.0

高级分析：

共现网络（Cytoscape）、环境因子关联（RDA/CCA）、物种-功能关联：将转录本同时注释物种来源和功能，解析“谁在表达什么基因”。

【翌圣生物·粪便微生物研究NGS完整解决方案】

产品类别	产品名称	货号
核酸提取	磁珠法土壤/粪便 DNA 提取试剂盒	18526ES
核酸提取	MolPure® Pro Soil/ StoolDNA Kit 增强版土壤/粪便 DNA 提取试剂盒	18527ES
16SrRNA基因二代建库试剂盒	16S（V3-V4）Bacterial AmpSeq Prep Kit For Illumina/ Illumina平台16S扩增子建库试剂盒	12983ES
	6S（V3-V4）Bacterial AmpSeq Prep Kit For MGI 16S（V3-V4）细菌扩增子建库试剂盒（MGI）	12833ES
	6S（V4）Bacterial AmpSeq Prep Kit For Illumina 16S（V4）细菌扩增子建库试剂盒（Illumina）	12834ES
	16S（V4）细菌扩增子建库试剂盒（For MGI）	12933ES
多重扩增Mix	2×Hieff NGS® HG MμLtiplex PCR Master Mix	13283ES
多重扩增Mix	2×Hieff® C2P4 Blood Direct MμLtiplex PCR Master Mix	13606ES
多重高保真Mix	2× Hieff Canace® Pro Amplification Mix	12980ES
16S全长扩增	Hieff NGS® Multiplex Long PCR Master Mix/ 长片段多重扩增酶	17228ES
宏基因组建库	Hieff NGS® DNA Library Prep Kit 2.0 机械法DNA建库试剂盒	12927ES
	Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 一步法DNA酶切建库试剂盒V4	12972ES
	Hieff NGS® C112P1 Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng)/ 1 ng 转座酶建库试剂盒	13468ES
	Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina（for 50ng）/ 50 ng转座酶建库试剂盒	12207ES
rRNA去除试剂盒	Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Prokaryote) with purification beads/磁珠法原核生物核糖体去除试剂盒（含古生菌）	12265ES
rRNA去除试剂盒	Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Bacteria(G- and G+)) with purification beads/磁珠法细菌核糖体去除试剂盒	12264ES
宏转录建库试剂盒	Hieff NGS® EvoMax RNA Library Prep Kit（dUTP）预混/预装板式RNA建库试剂盒	12340ES
	Hieff NGS® EvoMax RNA Library Prep Kit (dNTP)板式RNA建库试剂盒、预混版RNA建库试剂盒	12341ES
	Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version)/ 管式预混版本RNA建库试剂盒	12310ES
ONT建库试剂盒	Hieff® DNA Library Prep Kit for ONT （ONT平台三代建库试剂盒）	13301ES
ONT barcode	HieffTMNativeBarcodeKitforONT,Set1/Set2/Set3/Set4	13317-13320ES
MGI建库接头	Hieff NGS® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®	13350-13353ES
Illumina建库接头	Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®Set1/Set2/Set3/Set4（板式）	12327-12330ES
Illumina建库接头	Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®	17265ES
纯化磁珠	Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠	12601ES
文库定量	1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂	12642ES
环化	MGI环化试剂	13340/13341/13342ES