实验所用试剂清单

试剂名称	货号
Hieff Trans® LipoBooster 3000 Transfection Reagent Lipo3000转染试剂	40801ES

细胞培养与传代（T25）

细胞计数：从培养箱取出细胞，细胞悬液吹打混匀，使用细胞计数仪检测细胞活率及密度。

细胞传代（直接稀释法）：根据计数结果，将细胞按照5E6 cell/mL左右进行细胞传代。

细胞传代（半换液法）：若待传代细胞上清较黄，取出细胞后，使细胞继续保持静置状态，将培养板微微倾斜，使细胞沉于底部，用移液器将细胞上清液去除，再补充新鲜培养基进行计数传代。

细胞传代（离心换液法）：若细胞状态不好，可以通过低速离心进行传代；将待传代细胞悬液移至无菌离心管中，200 ×g 离心3-5分钟，新鲜培养基重悬并计数传代。

细胞转染（6孔板）

一、 实验前准备

1. 细胞准备：转染前24小时，取细胞悬液，进行细胞计数。按照5E6 cell/mL进行传代，每孔加入2 mL完全培养基（指培养基总量）。

2. 试剂准备：

o 质粒DNA： 使用高纯度（如试剂盒提取）的质粒DNA，质粒浓度最好高于1000 ng/μL。

o 转染试剂： 将LipoBooster 3000试剂在4°C冰箱外静置回温，使用前轻轻吹打。

o 无血清培养基： 准备用于稀释DNA和转染试剂的基础培养基（如Opti-MEM）。

二、 转染复合物制备

1. 稀释DNA：取一个无菌离心管，加入125 μL的opti-MEM无血清培养基，再加入2.5 μg质粒DNA，轻轻混匀。然后再加入5 μL的Enhancer增强剂，吹打混匀，获得稀释的质粒DNA溶液。

2. 稀释转染试剂：取另一个无菌离心管， 125 μL的opti-MEM无血清培养基，再加入5 μL的LipoBooster 3000转染试剂轻轻吹打混匀。

3. 混合孵育： 将稀释好的DNA溶液加入稀释的转染试剂管中，轻轻吹打混匀。室温下静置孵育10-15分钟，以形成稳定的DNA-转染试剂复合物。

三、 细胞转染

1. 加复合物： 将孵育好的DNA-转染试剂复合物逐滴均匀地加入到细胞培养基中，轻轻摇晃培养板使其混匀。

2. 孵育： 将细胞放回37°C、5% CO₂培养箱中培养。

四、 转染后处理

1. 换液： 转染后4-6小时，仔细观察细胞状态。若出现明显毒性，应吸弃部分上清培养基，并补充对应体积的新鲜预热的完全培养基。若细胞状态良好，可以不换液。

2. 检测： 继续培养24-72小时后，根据实验设计（如表达荧光蛋白、检测mRNA或蛋白水平）进行转染效率或功能检测。

小贴士：

1、如果转染后有显著的细胞毒性，可以在6h换液或将增强剂用量减半，可以避免细胞毒性问题；

2、如果转染效率比较低，可以通过提高转染试剂用量，能够有效提高转染效率；

3、稀释质粒和转染试剂，最好使用opti-MEM，效果会优于DMEM；

4、转染试剂兼容血清和双抗，但是稀释质粒和转染试剂用的必须是无血清无双抗培养基。

实验结果分析

 

在sf9昆虫卵巢细胞转染质粒DNA（6738bp），用翌圣 LipoBooster 3000及进口品牌T2000转染，并通过荧光显微镜观察转染效率。

进口品牌T2000	翌圣lipoBooster3000
数据来源：浙理工绍兴生物医药研究院

使用翌圣 LipoBooster 3000转染试剂在sf9昆虫卵巢细胞转染质粒DNA，结果显示，翌圣 LipoBooster 3000 转染试剂能够高效转染。

不同培养皿LipoBooster3000转染试剂用量使用指南

培养容器	培养基用量		DNA转染			siRNA转染（终浓度50 nM）
	培养基体积	复合物中Opti-MEM体积	DNA（μg）	LipoBooster 3000转染试剂（μL）	Enhancer转染增强剂（μL）	siRNA体积（初始浓度20 μM）	LipoBooster 3000转染试剂（μL）
96孔	100 μL	2×5 μL	0.1	0.2	0.2	0.25 μL	0.3
48孔	250 μL	2×12.5 μL	0.25	0.5	0.5	0.625 μL	0.75
24孔	500 μL	2×25 μL	0.5	1	1	1.25 μL	1.5
12孔	1 mL	2×50 μL	1	2	2	2.5 μL	3
6孔	2 mL	2×125 μL	2.5	5	5	5 μL	7.5
60 mm	5 mL	2×250 μL	5-10	10-20	10-20	12.5 μL	20
10 cm	10 mL	2×500 μL	15-25	30-50	30-50	25 μL	40
T25	6 mL	2×250 μL	6-12	12-24	12-24	15 μL	24
T75	15 mL	2×750 μL	20-40	40-80	40-80	37.5 μL	60

文末福利

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