Mouse Th17 Cell Polarization Kit 小鼠Th17极化试剂盒_92682ES（92682ES）

本套装专为小鼠初始 Naive CD4⁺T 细胞体外定向诱导分化为 Th17 细胞设计，采用经过验证的细胞因子 + 抗体组合，可高效驱动 Naive CD4⁺T 向 Th17 亚型极化，稳定获得 IL-17A 阳性 Th17 细胞，适用于免疫学机制研究、细胞功能验证、重组蛋白活性检测、药物筛选等体外细胞实验。

产品组分

注：部分试剂可能有剩余

复溶方法

操作步骤

Naïve CD4⁺T细胞的Th17极化诱导实验步骤

1. 包被抗CD3ε/CD28 mAb以激活T细胞

1.1使用无菌PBS将抗小鼠CD3ε单克隆抗体和抗小鼠CD28单克隆抗体一起稀释终浓度分别为10 µg/mL和2 µg/mL。

1.2向48孔细胞培养板的每孔加入500 µL上述抗体混合液，确保液体覆盖孔底。

1.3将培养板置于4°C冰箱中，包被过夜（约16-18小时）。

2. 接种细胞并启动Th17极化

T 细胞极化实验中，需将细胞重悬于完全培养基，细胞稀释浓度与铺板密度二者都很关键，以此保证细胞获得最佳刺激与生长状态。

下表为不同板型的推荐铺板量：

2.1 次日，吸弃孔内包被液，用预冷的无菌PBS轻柔洗涤孔板2-3次，以去除未结合的抗体。

2.2 将经CD4⁺  T( 37607ES10)细胞分选磁珠分选获得的、纯度>95%的小鼠脾脏CD4⁺ T细胞，以 (4-5)×10^5 cells/mL的浓度重悬于Th17极化完全培养基中。

Th17极化完全培养基配方：RPMI-1640基础培养基，补充10%胎牛血清、55 µM β-巯基乙醇、50 ng/mL重组小鼠IL-6、30 ng/mL重组小鼠TGF-β1、10 ng/mL重组小鼠IL-23、50 ng/mL重组小鼠IL-1β、10 µg/mL抗小鼠IFN-γ功能性抗体、10 µg/mL抗小鼠IL-2功能性抗体及10 µg/mL抗小鼠IL-4功能性抗体。

2.3取500 µL细胞悬液接种至已包被的48孔板的每个孔中。置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。

3. 培养维持与细胞扩增

3.1 培养48小时后，轻柔吹打并收集细胞悬液，300×g离心5分钟。

3.2 弃上清，用新鲜的Th17极化完全培养基将细胞重悬，并将细胞密度调整至 1×10^6 cells/mL，重新接种至新孔板中继续培养。(细胞量多，体积大可选择接种至24孔板中，每孔1mL)

3.3 此后，每12小时在倒置显微镜下观察细胞密度及状态。若细胞密度过高（例如 >2×10^6 cells/mL），则进行半量换液或按适当比例将细胞分至新的孔中，并补充新鲜Th17极化完全培养基，以维持细胞最佳生长状态。(细胞量多，体积大可选择接种至6孔板中，每孔2-3mL)

4. 细胞再刺激与胞内因子捕获

培养至第5天，收集细胞，用预冷的PBS洗涤一次后，使用含 10 ng/mL PMA、1 µg/mL Ionomycin及10 µg/mL Brefeldin A 的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，调整密度至 1×10^6 cells/mL，于37°C、5% CO₂培养箱中避光共刺激孵育5小时。

阴性对照组（Th0）设置

为评估极化的特异性，平行设置Th0阴性对照组。其流程与上述Th17诱导组基本相同，主要区别在于所使用的培养基不同：

1. 使用不同的维持培养基：使用Th0维持培养基，其组成为RPMI-1640基础培养基，补充10%胎牛血清、55 µM β-巯基乙醇、10 µg/mL抗小鼠IFN-γ及10 µg/mL抗小鼠IL-4功能性抗体。

2. 不添加极化细胞因子：该培养基中不添加极化细胞因子。

除上述培养基差异外，细胞接种、换液、密度监控及第5天的再刺激步骤均与Th17诱导组相同。

流式细胞术检测

1. 收集细胞：收集细胞，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将细胞用PBS轻轻吹打重悬；

2. 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，300×g，离心5min，弃上清；

3. 死活染料染色：按照100μl/1e6浓度加入稀释好的死活染料(稀释方法参考说明书）;

4. 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，300×g，离心5min，去除残留的死活染料；

5. 细胞固定：用PBS将细胞按照1e7/ml重悬，100μl/孔加至96孔板，300×g，离心5min，弃上清；每孔加入200μl 4% PFA，室温避光放置15min;

6. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μl PBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留的固定剂；

7. 细胞破膜：每孔加入200μl fixation/permeabilization solution，4~8℃冰箱孵育30min；

8. 细胞封闭：每孔加入100μl 1×BD Perm/Wash™ Buffer，并加入Mouse IgG进行细胞封闭（步骤7与步骤8可同时进行），随后300×g，离心5min，弃上清；

9. 孵育抗体：每孔加入100μl 1×BD Perm/Wash™ Buffer并加入孵育抗体Mouse Th1/Th2/Th17 Phenotyping Kit (抗体用量参考说明书）;

10. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μl PBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留抗体，随后用100μl~200μl重悬细胞；

11. 上机检测。

1.配方精准优化，定向分化效率高

2.全组分人源化，细胞活性优异

3. 批间质控严格，实验重复性稳定