烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是细胞中发现的两种重要的辅助因子。NADH是NAD+的还原形式，NAD+是NADH的氧化形式。NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂，光合作用产生的NADPH被用作光合作用卡尔文循环中生物合成反应的还原力。传统的NAD/NADH和NADP/ NADPH测定通过监测340 nm处的NADH或NADPH吸收的变化来完成，但测定的短UV波长使得这些方法具有低灵敏度和高干扰，且该分析是在紫外范围内进行的，需要昂贵的石英微孔板。

翌圣生物提供的Total NAD and NADH Fluorimetric Detection Assay Kit（Red Fluorescence）总NAD和NADH荧光检测试剂盒（红色荧光）为检测NAD和NADH提供了一种便捷的方法，系统中的酶会在酶循环反应中识别NAD和NADH，不需要从样品混合物中纯化NAD/NADH。此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了生物样品引起的干扰。本试剂盒可以用于96或384微孔板分析，其信号可通过荧光酶标仪（Ex/Em=540/590 nm）或吸光度酶标仪（~576 nm）轻松读取，建议使用纯黑色的孔板。

组分信息

注意事项

1. 数据分析时注意空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，作图时每个数据点需减去空白孔的荧光强度值。
2. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
4. 本产品仅作科研用途！

使用说明

1.溶液制备

1.1准备NADH标准品的储备溶液（1 mM）

将200 μL PBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中以制备1 mM的NADH储备溶液。 【注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-25~-15℃。】

1.2.准备NAD/NADH反应混合物

将10 mL的NADH Sensor Buffer（组分B）加入NAD/NADH Recycling Enzyme Mix（组分A）的瓶中，并充分混合。【注意：配制的NAD/NADH反应混合物足以用于两个96孔或四个384孔板。未使用的NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并避光储存在-25~-15℃。】

1.3准备NADH标准品的系列稀释液（0.0138至10 μM）

将10 μL的NADH储备溶液（来自步骤1.1）加入到990 μL PBS缓冲液（pH=7.4）中以产生10 μM的NADH标准溶液（NS7）。然后按照1：2比例依次稀释以获得其他浓度的NADH标准品（NS6-NS1）。【注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。浓度信息为：NS6：3.3333 μM；NS5：1.1111 μM；NS4：0.3704 μM；NS3：0.1235 μM；NS2：0.0412 μM；NS1：0.0138 μM】。

2.样品分析

2.1根据表1和表2中提供的布局，将NADH标准品和含NAD/NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。

2.2将50 μL的NAD/NADH反应混合物（来自步骤1.2）加入NADH标准品、空白对照和测试样品（来自步骤1.3）的每个孔中，使得总NADH测定体积为100 μL/孔。注意：对于384孔板，每孔加入25 μL样品和25 μL的NADH反应混合物，总体积为50 μL/孔。

2.3将反应混合物在室温下孵育15分钟至2小时，避光。

2.4荧光酶标仪下测量荧光数值，Ex/Em=540/590 nm。【注：也可测量Ex/Em=530-570/590-600 nm的荧光数值，但Ex/Em=540/590 nm处最佳。也可将板的内容物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。】

表1 实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局[NS=NADH标准品；BL=空白对照；TS=测试样品]

注意：将连续稀释的NADH标准品（0.0138至10 μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。高浓度的NADH（例如，>100 μM，最终浓度）可能由于NADH传感器（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

表2 每个孔的试剂组成

3.实验方案概述

3.1在开始实验之前，将所有试剂盒组件解冻至室温。

3.2准备NAD/NADH反应混合物（50 μL）。

3.3添加NADH标准品或测试样品（50 μL）。

3.4在室温下孵育15分钟到2小时，避光。

3.5监测Ex/Em=540/590 nm处的荧光强度。

4.数据分析

空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，从NADH反应的那些孔的值中减去该值，绘制NADH标准曲线如图1所示。注意：作图时每个数据点需减去空白孔的荧光强度值。

图1 使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech）在96孔黑色板中用总NAD和NADH荧光检测试剂盒测量NADH[在孵育1 h时，可以检测到低至100 nM的NADH，而NADPH没有响应]

-25~-15℃避光保存，有效期12个月。