背景介绍

溶酶体是一种分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的细胞器。溶酶体具单层膜囊状结构，内含60余种酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶等，分解各种外源和内源的大分子物质。溶酶体水解酶的最适pH为3.5~5.5，溶酶体内的酸性环境是依靠膜上的特殊转运蛋白(H泵)来维持的。溶酶体标志酶为酸性磷酸酶，目前针对溶酶体的定位也主要围绕酸性磷酸酶展开。

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图1. 溶酶体结构

溶酶体功能

溶酶体存在着形态上的多样性和异质性，根据溶酶体处于完成其生理功能的不同阶段，大致分为以下几种：

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图2.溶酶体分类及功能

溶酶体的主要功能是消化作用，主要通过三种途径消化底物：1.自体吞噬细胞内原有的物质；2吞噬体吞噬有害物质；3.通过内吞作用提供的营养物质。吞噬作用也是细胞获取营养的一种方式，细胞通过内吞作用将一些营养物质包进内吞体，在溶酶体酶的作用下，将吞进的营养物质消化，用于合成代谢。

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图3.溶酶体吞噬作用

溶酶体疾病及检测手段

溶酶体的酶发生变异，导致底物在溶酶体中大量堆积，影响细胞功能异常引起的疾病称为溶酶体病。溶酶体与许多疾病的发生有着极为密切的关系，例如炎症、矽肺、尤其是先天性溶酶体缺陷等疾病都与溶酶体机能异常有关。溶酶体异常还与休克、类风湿关节炎、肿瘤等疾病发生有关联。

目前检测溶酶体异常的手段有很多，包括光镜鉴定法、电镜鉴定法、.细胞学检测法等等，这些方法可以直接检测到溶酶体外形结构、通透性、pH变化等等。目前人类也开发了一系列溶酶体检测试剂盒，包括细胞膜通透性（LAP）完成性吖啶橙染色试剂、LAMP抗体及二抗，还包括溶酶体探针类染料，LysoTracker探针和LysoSensor探针。LysoTracker探针和LysoSensor探针可以选择性地标记和追踪活细胞酸性细胞器。

Yeasen生物提供多款不同荧光基团标记的溶酶体探针如：绿色、红色、黄色荧光基团等等，满足您多标实验的不同需求。

产品简介

LysoTracker探针

LysoTracker探针，由荧光基团连接到一个弱碱性基团组成，其中仅弱碱基团可部分提供质子，以维持pH在中性值。这使LysoTracker探针可自由无阻地穿过细胞膜，特征性的聚集在球形细胞器，对酸性细胞器有高选择性，用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。机制尚不明确，可能涉及细胞器膜上的质子化和滞留，一般后面处理细胞的弱碱性渗透剂不会逆转染色效果。LysoTracker荧光可能在整个细胞内荧光中占很小部分，因此很难通过流式或荧光计定量溶酶体数量。

LysoSensor探针

LysoSensor探针是细胞内的pH荧光指示剂，可通过质子化作用聚集在酸性细胞器内。这个质子化也减弱染料的荧光淬灭性，从而增加荧光强度。因此，与LysoTracker系列探针相比，LysoSensor系列探针随着细胞器的酸化程度增强，其荧光强度呈极大的pH依赖型(向酸)增强。

产品选择指南

产品名称	LysoTracker Green DND-26 溶酶体绿色荧光探针 40738ES50-50 μL	LysoTracker Red DND-99 溶酶体红色荧光探针 40739ES50-50 μL	LysoSensor™ Green DND-189 溶酶体绿色荧光探针 40767ES50-50 μL	LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160(PDMPO)溶酶体黄/蓝色荧光探针 40768ES50-50 μL
功能	溶酶体示踪检测，以及pH依赖性
靶标	标记活细胞状态下的酸性细胞器
常用检测通道	FITC	TRITC	FITC	DAPI or UV longpass
标记颜色	绿色	红色	绿色	黄色/蓝色
Ex/Em (nm)	504/511	579/590	443/505	329/384（蓝） 440/540（黄）
光稳定性	较稳定	较稳定	较稳定	较稳定
染色状态	活细胞	活细胞	活细胞	活细胞
是否可以固定细胞	否	否	否	否
检测平台	显微镜成像	显微镜成像	显微镜成像	显微镜成像
产品简介	LysoTracker染料几乎不对线粒体染色，可用于活细胞中酸性细胞器的标记和追踪。		LysoSensor™染料为活细胞染料，荧光强度呈极大的pH依赖型(向酸)增强。

注：探针标记细胞后，只能用荧光显微镜观察，而不能用流式或荧光酶标仪检测，因为在总细胞荧光中溶酶体荧光只占非常小的比例。

产品特点

特异性强：高选择性地识别和标记靶向酸性细胞器，几乎不对线粒体染色；

种类齐全：多种荧光颜色可供选择、可与其他荧光染料或蛋白同时使用进行多色分析；

简单方便：自由渗透细胞膜，一步法染色、标记活细胞细胞器--溶酶体，染料可快速导入；

灵敏度高：纳摩尔浓度水平标记活细胞的效果较高。

染色结果

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图5A.4T1细胞染色结果图。绿色是FITC标记细胞，红色是LysoTracker Red DND-99 染色溶酶体。

参考文献：Di L, Yang A , Simin F , et al. Imidazole-Bearing Polymeric Micelles for Enhanced Cellular Uptake, Rapid Endosomal Escape, and On-demand Cargo Release[J]. AAPS PharmSciTech, 2018. 19(6), 2610–2619.

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图5B. Hela细胞染色结果图。(a) Lyso-Tracker Red DND-99染色Hela细胞；(b) Lysosensor Green DND-189染色Hela细胞

参考文献：Zhang L, Chen X,, et al. Palladium nanoparticles induce autophagy and autophagic flux blockade in Hela cells. RSC Advances, 2018,8(8), 4130–4141.

FAQ

问题类别	问	答
实验咨询	1.四种溶酶体探针的区别？	LysoTracker®--不依赖pH的活细胞溶酶体荧光探针（货号40738和40739）； LysoSensor™--依赖pH的活细胞溶酶体荧光探针（货号40767和40768）。
	2.LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO探针原理？	LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO)是一种pH依赖型显示双激发和双发射波长的荧光探针：
	3.染色时，细胞的状态？	这四种探针是对活细胞中的酸性区室进行染色。所以必须要在活细胞状态下染色。
	4.染色完成后，细胞是否能固定后再检测荧光信号？	固定后会破坏溶酶体的酸性环境从而会造成荧光减弱甚至消失的情况，染色前后均不建议固定。
	5.可以和二抗一起孵育吗？	不可以，孵育二抗必须要透化处理，而透化会破坏溶酶体的酸性环境，影响染色效果。
	6.这个探针可以染自噬溶酶体吗	自噬溶酶体和正常的溶酶体在形态结构上有较大差异，该探针主要是针对常规的溶酶体染色，对于自噬溶酶体的染色效果不是很确定，可以参考一些使用过该产品发表的文献资料确定。
	7.植物细胞和组织适用吗？	理论上可以，一般植物细胞或者组织要制成原生质体。
	8.可以染色其他酸性细胞器吗？	可以染色其他酸性细胞器，建议极低浓度下才能优先选择染色酸性溶酶体。
	9.染色后可以放置一夜，再荧光检测吗？	建议染色完立即检测荧光，时间过长，荧光信号会逐渐减弱。
	10.用细胞培养基配成工作液以后稳定吗？可以存放多久？	工作液是需要现配现用的，不建议保存。
	11.检测仪器？	荧光显微镜、共聚焦显微镜、酶标仪、流式细胞仪。
	12.如何做到同时染色溶酶体和细胞核的？	建议用Hoechst 33258/ Hoechst 33342染色细胞核，这个染料可以直接染活细胞不需要固定操作。
	13.保质期多久？	-20℃避光保存，半年有效。
实验问题	14.荧光信号较弱？	大致有3个原因： 1.溶酶体探针浓度过低，建议适当增大浓度； 2.染色时间过短，建议延长染色时间； 3.染色完之后，放置过长时间才检测信号；建议染色完立刻检测。
	15．没有荧光信号？	大致有3个原因： 1.先用多聚甲醛、乙醛等固定细胞，破坏了溶酶体的酸性环境。 2.染色完后，又用多聚甲醛固定细胞，或者透化细胞，破坏了溶酶体的酸性环境；染色前后均不建议固定细胞； 3.染色完到上机检测这一段时间过长，并且没有避光处理。建议避光染色，染色完立即检测荧光信号。
	16.在活细胞状态下，用50 µM探针染色50 min，然后发现除了溶酶体，细胞质中也有荧光信号，这主要是什么原因导致？	大致有一下3个原因： 1.溶酶体探针浓度过大，建议适当降低浓度； 2.溶酶体探针染色时间过长，建议适当缩短时间。

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