为什么CQ氯喹处理后的细胞使用溶酶体探针染色反而更亮
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2026-08-11
染色示例
图1、用共聚焦显微镜观察在10% FBS 、Pristane或氯喹 (CQ，30μM) 处理20 小时的RAW264.7 细胞中的溶酶体，溶酶体使用LysoTracker Green DND26（50 nM）和Hoechst 33342（5 µg/ml）进行染色[1]。
图2、用共聚焦显微镜观察在对照、Baf A1 (100nM，5h) 、CQ（100μM，5h）的U2OS 细胞中的溶酶体，溶酶体使用LysoTracker Red和Hoechst 33342进行染色[2]。
图3、从左到右依次为对照、Baf A1（30nM，1h）、Baf A1（100nM，1h）、CQ（30μM，1h）、CQ（100μM，1h）的Hela细胞中使用Lysosensor Green DND-189进行溶酶体染色的结果。
如上示例中均可见：无论使用Lysotracker还是使用Lysosensor对溶酶体进行检测均会出现在CQ处理的细胞中呈现荧光强度增加的结果，但Baf A1处理细胞中荧光强度则是降低的。
在体外实验中常将Baf A1（巴佛洛霉素A1）、CQ（氯喹）作为溶酶体抑制剂使用，认为它们可以升高溶酶体pH，对溶酶体进行降解。但为什么在使用Lysosensor或Lysotracker溶酶体探针检测后会出现CQ处理细胞中信号更强？下面从探针本身的染色原理、CQ作用机制两方面来解释这一现象。
溶酶体探针染色原理
溶酶体探针分为Lysosensor及Lysotracker两个系列共四款，原理如下：
Lysotracker探针
LysoTracker探针由荧光基团与弱碱性基团偶联而成，该弱碱在中性pH环境下仅发生部分质子化，但对低pH的酸性细胞器特异性高，纳摩尔浓度下即可实现活细胞酸性细胞器的高效标记。只是目前探针的滞留机制未明确，推测是依靠质子化作用停留在细胞器内。
Lysosensor探针
Lysosensor染料同为嗜酸性探针，依靠质子化作用富集在酸性细胞器中。质子化过程还能解除染料弱碱性侧链带来的荧光淬灭效应，使荧光强度升高，所以其荧光强度会随环境酸化呈现pH依赖性增强的现象，而LysoTracker探针的荧光信号基本不受pH变化影响。
其中LysoSensor Yellow/Blue DND-160（PDMPO）拥有两组激发峰与两组发射峰，在活细胞内可呈现依赖pH的双发射光谱。在酸性细胞器内DND-160主要发出黄色荧光；当pH升高时则以蓝色荧光为主。
表1、溶酶体荧光探针汇总
|
探针 |
Ex/Em(nm) |
pKa |
pH有效范围 |
|
504/511 |
\ |
\ |
|
|
577/590 |
\ |
\ |
|
|
443/505 |
5.2 |
4.5–6.0 |
|
|
329/440(Blue) 384/540(Yellow) |
4.2 |
3.5–6.0 |
注：pKa是酸解离常数的负对数，代表质子化与去质子化染料分子等量共存时的pH值，也就是质子化探针与去质子化探针分子数量为1:1，两种形态各占一半时的pH。当pH＜pKa更酸时探针以质子化形态为主，当pH＞pKa偏碱时探针以去质子化形态为主。
CQ作用机制
在体外实验中常将Baf A1、CQ、溶酶体蛋白酶抑制剂等同视为晚期自噬阻断剂，在文献[2]中系统对比Baf A1和CQ两种药物对细胞器形态、自噬全过程、胞吞转运的影响，发现二者存在根本性的区别：从降解区室形态、溶酶体酸度层面，Baf A1处理溶酶体内可见完整未降解胞质内容物，溶酶体酸性完全丧失，符合抑制溶酶水解酶的经典机制；但CQ氯喹处理溶酶体保留酸性，腔内底物完全浓缩降解，说明溶酶体水解酶功能完好。
通过使用LysoTracker也证实常规给药浓度下CQ不会持续影响溶酶体pH。 对CQ调控溶酶体pH的争议，其中一方面原因是LysoTracker染料本身的局限性，正如上面Lysotracker染色原理提到该探针荧光信号基本不受pH变化影响，仅是在pH＞6.5时荧光减弱或消失，不能精准反映精细pH变化；同时CQ仅短暂一次性升高溶酶体pH，细胞会快速代偿恢复酸性，该瞬时效应会在不同细胞系存在差异。
另外CQ作为溶酶体嗜碱性阳离子药物，会因渗透压失衡诱导溶酶体膨大形成vDGC（液泡型降解区室）。长期给药后溶酶体持续吸水稀释腔内蛋白与水解酶，但酶本身活性并未降低或丧失。CQ短期处理会形成溶酶体聚集，长期处理会形成透亮液泡型vDGC。 以往的研究仅观察到CQ造成自噬体堆积，但无法区分该现象源于融合阻断还是溶酶体降解抑制。该文献明确了：CQ阻断自噬体与溶酶体的膜融合，而非抑制溶酶体使其内部降解。
总结
综合CQ的作用机制：因其并未破坏溶酶体酸性，抑制溶酶体内部酶降解能力，以及Lysosensor及Lysotracker检测溶酶体的原理，当遇到在CQ处理细胞中探针荧光强度增强时并非为异常情况。
另外相较于CQ，用于指示溶酶体pH升高的对照试剂应选择Baf A1。
参考文献
[1]Han S,Zhuang H,Diao Y, et al. Altered lipid homeostasis and autophagy precipitate diffuse alveolar hemorrhage in murine lupus. Autophagy Rep. 2024;3 (1):. doi:10.1080/27694127.2024.2379193
[2]Mauthe M,Orhon I,Rocchi C, et al. Chloroquine inhibits autophagic flux by decreasing autophagosome-lysosome fusion. Autophagy. 2018;14 (8):1435-1455. doi:10.1080/15548627.2018.1474314
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