口腔微生物研究

长期以来，口腔微生物研究依赖于平板培养和镜检等方法。传统培养方法虽然历史悠久，但在检测不可培养或苛养微生物方面存在显著局限。分子生物学技术，特别是16S和18S rRNA测序的出现，彻底改变了口腔微生物研究的面貌。以16S rRNA基因为靶标的高通量测序技术，突破了培养局限，实现了对复杂微生物群落的快速、高分辨率解析。

当前，NGS技术在口腔微生物研究中的应用已从单纯的物种组成描述，拓展至功能基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学层面，为研究者提供了口腔微生物组成、功能和互作关系的整体认知。人类口腔微生物组数据库（HOMD）和口腔微生物组数据库（OMD）等专业数据库的建立，为数据比对和功能注释提供了重要支撑。

图1 微生物群在不同口腔栖息地定植的生物地理学

龋病是全球最常见的口腔疾病之一。NGS技术为揭示龋病相关的微生物群落变化提供了全新视角。通过对龋病和健康儿童口腔微生物群落的16S rRNA测序，可揭示两组儿童口腔微生物群落的活性物种组成和多样性差异。高通量测序技术可分析低龄儿童龋病口腔微生物菌群结构及其与唾液生化指标的关联。全长16S rRNA测序技术也被用于鉴定成年人龋齿牙菌斑微生物。

牙周炎是一种影响全球大量人口的慢性炎症性疾病，与心血管疾病、吸入性肺炎和癌症等全身性疾病存在关联。龈下菌群微生物被认为是牙周炎的主要驱动因素。利用PacBio长读长测序对34例重度牙周炎患者的龈下菌斑、龈上菌斑和舌苔微生物群进行全长16S rRNA基因测序和ASV分析，发现龈下和龈上菌斑的α和β多样性均与舌苔微生物群存在显著差异。唾液微生物组作为牙周炎的诊断生物标志物也受到广泛关注。结合定量和相对微生物组分析可揭示与牙周健康及不同牙周炎阶段相关的唾液菌群变化。

口腔微生物群落在口腔潜在恶性疾病（如白斑、口腔黏膜下纤维化）和口腔鳞状细胞癌中的变化，为无创早期筛查提供了新思路。通过对正常、口腔潜在恶性疾病和口腔鳞状细胞癌样本进行16S rRNA基因NGS测序和生物信息学分析，可揭示与疾病进展相关的微生物特征。从采样到分析的全流程策略研究为口腔癌相关微生物组研究提供了方法学建议。

口腔微生物组不仅影响口腔健康，还与全身性疾病密切相关。16S rRNA基因测序技术可用于探究高龄老年人余留牙量与口腔微生物组的相关性。NGS技术为探究糖尿病对口腔细菌的影响提供了更广阔且深入的途径，目前研究中常用的16S rRNA基因测序和宏组学等技术可以更准确地研究细菌群落的组成、多样性、进化关系以及基因功能。

口腔样本的类型选择直接影响研究结果。常用样本包括唾液、口腔漱洗液、拭子、刷取物和组织活检等。不同口腔局部位点（如龈上菌斑、龈下菌斑、舌苔、颊黏膜等）的微生物分布模式存在差异。建议记录样本的采集部位、采集时间、受试者的口腔健康状况和用药史等临床元数据。样本采集后应尽快处理或置于适当的保存条件下（-80℃长期保存），避免反复冻融。

口腔样本的核酸提取质量直接影响后续建库和测序的成功率。取适量样本，采用机械研磨与化学裂解相结合的提取策略，确保革兰氏阳性菌及真菌孢子的有效裂解，然后利用基于磁珠或硅胶膜的纯化方法去除PCR抑制剂。

根据测序目标选择建库策略：

16S/ITS扩增子建库：采用两步PCR法，靶向V3-V4区或ITS等区域。

宏基因组建库：采用酶切法或超声打断片段化DNA，经末端修复、加A尾、连接接头后PCR扩增。也可以基于Tn5转座酶的“一步法”建库试剂盒可在2.5小时内完成建库，起始量低至1 ng。

宏转录组建库：流程相对复杂：

rRNA去除：总RNA中rRNA占比超过90%，需通过探针杂交去除。

链特异性建库：逆转录合成cDNA第一条链后，第二链合成时以dUTP取代dTTP，保留链方向信息。链特异性文库可提供更精准的基因定量和反义转录本信息。

扩增子测序：Illumina MiSeq/NovaSeq平台，PE250或PE300模式，每个样本建议5-10万条序列。

宏基因组测序：Illumina NovaSeq或DNBSEQ-T7平台，PE150模式，数据量5-10 Gb/样本（物种组成）或10-20 Gb/样本（功能解析）。

全长16S测序：PacBio/ONT平台，读长>1400 bp，直接获取完整可变区信息，分辨率达种水平。

宏转录组测序：Illumina NovaSeq平台，PE150，每个样本10-20 Gb数据。

核心分析内容：

质控与去噪：FastQC、cutadapt、DADA2

物种注释：HOMD、OMD、Kraken2、MetaPhlAn4

功能注释：PICRUSt2、HUMAnN3、KEGG、COG

高级分析：共现网络（Cytoscape）、物种-功能关联：将转录本同时注释物种来源和功能，解析“谁在表达什么基因”。

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