涨知识|克隆专题八：一步法快速克隆FAQ——常见问题解答
克隆技术，又称为“生物放大技术”，目前应用最广泛的技术为“分子克隆”，即通过重组技术将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。
大部分的分子克隆方法，诸如传统分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、无缝克隆等都绕不开目的片段制备、载体制备、连接、转化、筛选等等步骤。因为步骤较多且知识点复杂，在实验的过程中就会遇到各种各种的问题，尤其是各位科研儿们运用最多的同源重组技术。接下来小翌会具体解答一下同源重组中常见的问题，为您的实验提供好方法。
一步法快速克隆试剂盒运用到的分子克隆技术是什么？
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外切酶活性：该酶能特异性地识别载体和插入片段末端的15-25 bp的同源序列，并沿着5';→3';方向切割dsDNA，从而产生粘性末端，粘性末端的碱基在50℃作用下进行互补配对，将具备同源序列的载体与插入片段“融合”。 -
DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保证将片段和载体的5’末端都降解成一样长的粘性末端，同源末端退火配对后，还存在单链的碱基缺口。故需要借助DNA聚合酶活性进行修复。 -
连接酶活性：催化形成磷酸二酯键，将所有缺口缝合。
图1.同源重组原理
与传统分子克隆相比，一步法快速克隆试剂盒有什么优势？
应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变；
设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5’端引入15-25 bp与载体末端同源的序列即可。
一步法克隆试剂盒连接反应总体系20 μL，但载体/片段浓度低可否使用小体系连接？
超短片段高效率重组
多片段高效率重组
一步法克隆连接后无阳性克隆或者菌落数少，是什么原因造成的，该怎么解决呢？
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出现问题 |
原因分析 |
解决方法 |
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无克隆长出或克隆数较少？ |
原因1：引物设计错误 |
①设计原则：同源臂（15-25bp，GC含量40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物（常规插入片段扩增引物）。 ②判断方法：使用翌圣无缝克隆引物设计软件核对（https://www.yeasen.com/hieff-clone/）。 |
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原因2：线性化载体与目的片段使用量错误 |
线性化载体与目的片段添加比例：最适载体与目的片段摩尔比为1:2-1:3，最适载体使用量为0.03 pmol；最适目的片段使用量为0.06-0.09 pmol。 注：a、片段长度大于载体时，最适载体与目的片段使用量的计算方式应互换，即目的片段当做载体，载体当做目的片段进行计算。 b、线性化载体的使用量应在50-200ng之间；目的片段扩增产物的使用量应在20-200ng之间。当使用上述公式计算最适使用量超出这个范围时，则选择最低或最高使用量即可。 |
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原因3：载体与目的片段不纯 |
推荐对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂（如EDTA）的带入，故DNA纯化产物不能使用TE进行DNA保存，可溶解在pH8.0的ddH2O中保存。未纯化DNA加入重组反应体系内的总体积不应超过反应体系体积1/5。 |
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原因4：操作问题或试剂盒失效 |
推荐做试剂盒自带的阳性对照实验，若阳性对照有克隆并检测为阳性，则排除试剂盒问题。若阳性对照无克隆，可能是操作问题或试剂盒失效，建议换其他人进行阳性对照实验，进一步排除是否为操作问题。 |
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原因5：感受态细胞效率低，＜107cfu/μg |
转化效率检测方法：转化0.1ng质粒（如PUC19），生长1000个菌斑，估算转化效率为107cfu/μg。 |
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假阳性—不含插入片段（空载）？ |
原因1：载体线性化不完全 |
判断方法：将已制备的线性化的载体转化涂板，如果长克隆较多，则表示线性化不完全。 解决方案：若线性化不完全则需优化酶切体系，例如提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等。 |
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原因2：反应体系中混入了相同抗性的环状质粒 |
判断方法：将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板，如果长克隆较多，则表示有相同抗性的环状质粒混入。 解决方案：PCR扩增产物先用DpnI消化模板后，再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理，去除残留的环状模板质粒导致的假阳性。 |
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假阳性—含不正确的插入片段？ |
原因1：PCR产物混有非特异扩增产物 |
可能情况：PCR扩增目的基因时有非特异条带出现，未进行胶回收纯化。 解决方案： ①优化PCR体系，提高特异性； ②胶回收PCR产物； ③鉴定更多的克隆。 |
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原因2：片段缺失 |
可能情况：载体或片段有多个同源重复序列。 解决方案：借助网站或软件进行序列比对（如NCBI，VectorNTI等）。 |
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菌落PCR无目的条带？ |
原因1：菌落PCR引物错误 |
推荐使用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。 |
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原因2：PCR试剂Mix不稳定，PCR体系或程序不合适 |
①更换新的PCR试剂盒 ②优化PCR体系、程序； ③提取质粒，以质粒做模板PCR验证； ④换成质粒酶切鉴定阳性克隆。 |
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原因3：载体线性化不完全 |
可能情况：目的片段引物+一端载体通用引物，或另一端目的片段引物扩增无产物，而载体通用引物扩增有产物，且大小符合空载。 解决方案：优化酶切体系。例如提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等。 |
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测序后插入片段有缺失或者突变？ |
原因1：PCR扩增试剂的高保真性不强，导致位点缺失或突变 |
快速克隆试剂盒作用于15-25 bp的同源臂上，不会导致片段中间的位点缺失或者突变。 解决方案：更换保真性更高的PCR扩增试剂盒 |
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原因2：在切胶回收过程中，紫外下切胶过久导致突变 |
减少切胶时间，避免胶长时间暴露于紫外光下。 |
相关产品列表
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产品定位 |
产品名称 |
产品货号 |
规格 |
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1-7片段一步法定向连接，最快5分钟完成重组反应 |
Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit |
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Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit |
20 T |
