ELISA 实验样本处理和数据分析指南

ELISA 检测的信号强度与待测物浓度之间并非线性关系，而呈典型的 S 型剂量—响应曲线。这一特性决定了：任何在前处理、孵育、洗涤或读数环节引入的系统性偏差，都会被 S 型曲线放大，最终反映为浓度计算结果的显著偏移。

1. 通用原则

2. 各类样本的采集与处理方法

其他不常见的样本类型，建议查阅相关文献或通过预实验验证适用性。

3. 样本保存与稳定性

保存时限： 2–8℃ 可保存 48 h；−20℃ 可保存 1 个月；−80℃ 可保存 6 个月。

关键控制点：

1、移液操作

移液精度直接决定孔间一致性，是重复性误差的主要来源之一。控制要点如下：

●取用新枪头时检查枪头规格是否匹配、安装是否牢固；

●选择合适量程的移液枪，避免使用量程过大或过小的移液器；

●同一标本的复孔加样可不更换枪头；不同样本或不同浓度标准品之间必须更换枪头，避免交叉污染；

●更换枪头吸取反应液时先排出空气，避免加样时产生气泡；

●吸取黏稠样本时，枪头应在液面下停留至体积平衡后再移出；

●加样时枪头保持于液面以下，与孔壁保持一定角度，避免贴壁或触底——残留于非包被区的液体会导致实际加入量不足；

●样本与标准品加样建议使用多道移液器，可提高加样速度并改善孔间一致性；

●孵育时间应严格控制，建议每小时孵育时间误差控制在 ±5 min 以内。

2、洗板

洗涤是 ELISA 操作中影响背景与精密度的核心环节：洗涤不彻底导致本底升高，洗涤过度或孔内干燥则导致重复性变差。

●确保抽吸装置工作正常，每孔均被充分抽吸；

●孔内液体被完全抽走后，不要将抽吸头继续留置孔内过分抽吸；

●避免洗板速度过快或过慢、洗涤不完全或过度抽吸；

●最后一次洗板后倾倒、甩干或于干净纸巾上拍干；

确保各孔被充分洗涤但不出现孔内干燥，洗板后应迅速进入下一步操作。

3、孵育与防污染控制

●96 孔酶标板为单条可拆型，按需拆取使用；剩余板条应放回密封袋，4℃ 保存，避免污染。

●试剂分装体积通常略多于标签标示体积，使用时应量取而非直接倾倒。

●工作液建议即配即用。溶解后的蛋白应在 12 h 内使用；−20℃ 保存条件下 2 天内可用，但不得反复冻融。

●揭、盖封板膜时避免用力过大导致液体溅出，造成孔间交叉污染。

4、显色与终止

●TMB 显色液应为无色透明液体，按需取用，全程注意避光操作。

●终止液具有腐蚀性，操作时须做好防护，避免接触皮肤。

●终止液的加入顺序应与 TMB 显色液的加入顺序保持一致，以减少因反应时间差异引入的系统误差。

●加样时间、孵育温度与时间、洗板过程均会对结果产生影响，实验前应熟练掌握流程并严格控制条件。

ELISA 标准曲线可采用不同的绘图软件来绘制，推荐使用“ELISACalc”软件，以一组数据为例，绘制方法如下：

1）在 EXCEL 表格中整理一组包括标曲和样本数据；

2）打开软件 ELISACalc（此软件可在 www.boster.com 免费下载），复制表格中的数据，点击软件中的“粘贴”按钮。

左上角优先选择四参数拟合曲线，点击“回归/拟合”模型，得到曲线图；

4）曲线应为平滑上升趋势，r² 值越接近 1 拟合度越好。如果四参数模型不理想可以换成其他的模型。依次点击“回归方程”、“复制”，可以把方程粘贴到表格中；

5）点击“由 Y 计算 X”，复制表格中的样本吸光值（底色为黄色的数据），在软件中点击“粘贴”、“计算”，即可得到对应的样本蛋白浓度值；

6）点击“复制”，即可把得到的浓度值粘贴到表格中。整理数据，再乘以稀释倍数，得到对应样本蛋白最终浓度值。